给大家分享一篇发表在Naturecommunication上的文章，文章题目是“Engineering Af1521 improvesADP-ribose binding and identification of ADP-ribosylated proteins”。文章的通讯作者是苏黎世大学的Michael O. Hottiger，其团队主要研究方向为炎症相关疾病中的细胞信号转导，尤其是ADP-ribosylation这一种翻译后修饰在调节炎症信号通路的作用。

     二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation，ADPr）是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，它被发现广泛存在于多种病毒、细菌和真核生物体内。该修饰的发生通常由ADP-ribosyltransferase(ART)介导，通过将NAD+上的ADP-ribose(ADPr)转移至被修饰的蛋白上从而形成这一修饰。许多研究指出这类修饰可以通过氢键和疏水作用改变被修饰蛋白的酶活性，从而发挥其调控作用。该修饰在细胞内常常有两种存在形式——单体修饰(mono-ADP-ribosylation,MAR) 和多聚体修饰(polyADP-ribosylation, PAR)，然而在该种修饰在细胞内丰度相对较低并处于动态变化中，且长期以来一直缺乏商用的特异性抗体，这限制了人们对其进行大规模研究。

            核糖体展示（ribosome display）是一种无细胞表达系统，它通过在体外进行蛋白质翻译，将被展示蛋白表达在核糖体表面，并能够形成mRNA、核糖体和被展示蛋白三联复合体从而方便筛选。该系统因为具有文库容量大、筛选过程相对简便、易于进行分子重组和突变等优点而被广泛应用于蛋白质分子进化的研究。在本文章中，作者选取了一个已经被发现可以结合ADPr修饰的Af1521 macro domain，使用核糖体展示技术对其进行了定向进化，希望可以获得更高亲和力的人工改造Aft1521，以便应用于ADPr修饰蛋白的体外富集。

            作者首先使用了易错PCR技术（error-prone PCR）构建了Aft1521突变体文库，随后在核糖体展示系统中将其表达出来，通过发生了ADPr修饰的H2B肽段对其进行亲和力筛选。每一轮筛选都降低H2B肽段的含量并延长洗脱时间作为进化压力，经过四轮突变和筛选后，一种突变体eAf1521脱颖而出。该突变体较野生型Aft1521存在K35E和Y145R两处关键突变，这两个突变可以形成盐桥，为该结构域的ADPr结合区域提供一个刚性边界，并促使Arg的氮原子与ADPr的C-4‘链接的氧原子形成静电作用。

            随后，作者通过使用过氧化氢处理HeLa细胞，激活ARTD1，促使其蛋白质组整体发生ADPr修饰的水平上升。裂解细胞并进行酶切后，通过eAf1521对发生ADPr修饰的肽段进行富集，并进行质谱检测。结果发现eAf1521能够富集到的肽段数量和类型显著多于野生型Af1521。这证明了这一突变体具有较强的ADPr修饰亲和力，并可应用于该修饰在蛋白质组研究中的富集。

            此外，通过对富集到的被修饰肽段进行分析，作者还发现ADPr修饰大多发生在丝氨酸上，这类蛋白大多定位于细胞核内并可能受ARTD1的调控，在过氧化氢诱导后修饰量明显上升。另有一些ADPr修饰则发生在精氨酸上，且这类蛋白多定位在胞浆中，其修饰水平往往不随过氧化氢处理而明显改变，这可能暗示着有其他酶参与了其修饰的调控。

            最后，作者将该eAf1521结合在抗体Fc片段上，制成了一种可以用于免疫印记实验的重组蛋白，其在ADPr修饰的研究中能发挥类似于特异性抗体的作用。综上，本研究利用核糖体展示技术和定向进化策略，获取了一种eAf1521，将其应用于ADPr修饰的研究，为后续研究提供了新的工具和策略。

本文作者：MYZ

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-18981-w

原文引用：10.1038/s41467-020-18981-w