蛋白质的位点特异性标记是工业和学术研究中广泛采用的工具。转肽酶，如sortase、connectase、subtiligase和天冬酰胺内肽酶，提供了一种有效的策略，可以标记蛋白质的N-和C-末端。这种方法现已应用于越来越复杂的系统，包括细胞表面标记、体内标记和治疗性抗体-药物偶联物的制备。这些方法已经进行了多次改进，包括通过改进和改变活性的酶的演变，使用多个酶使得可以进行正交标记反应，以及开发标记内部残基的方法。然而，在几乎所有情况下，需要过量的其中一种反应物，以实现未标记蛋白质到标记蛋白质的完全转化。

        转肽酶在其底物蛋白质或肽段中识别一个定义好的肽段基序。活性位点的半胱氨酸残基与这个基序反应，生成一个巯基酰中间体，然后该中间体与底物肽或蛋白质反应，产生产物。这类标记反应的关键挑战在于它们通常是可逆的。酶的底物识别序列（例如sortase的LPXT/G）仍然存在于反应产物中，并且在形成初始巯基酰中间体的过程中产生的副产物也是第二步的底物。反应的可逆性导致它受到热力学控制，从而产生标记和未标记产物的平衡混合物。生产纯标记蛋白质通常需要大量过量的标记肽或者将未标记蛋白质从反应混合物中移除。对于N-末端标记，作者和其他人以前曾报道过使用酯/depsipeptide底物的方法，其中副产物是醇，不再是酶的底物。然而，这种策略对于C-末端标记不适用，因为它要求将酯键合并到表达的蛋白质中。因此，对于C-末端标记，已经开发了各种替代策略。例如，通过使用离心过滤装置物理去除副产物肽的C-末端标记，使用化学试剂与产物肽反应，或者使用高浓度的Ni²⁺进行螯合。在其他工作中，已经利用天冬酰胺内肽酶的底物偏好来实现产品的形成，该产品由酶效率低下地重新加工。然而，目前针对具有通用性的转肽酶进行化学计量、定量标记的策略仍然有限。

图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

       作者先前的工作使用了depsipeptides、使用固定sortases分离巯基酰中间体以及机械去除多肽副产物，所有这些都表明，如果能找到一种适当的方法来去除副产物，那么促使C-末端标记是可行的。作者假设一个适当的蛋白质修饰酶可能能够选择性地修改N-末端，从而促进定量的转肽反应。定量和选择性地标记蛋白质是学术界和工业实验室广泛采用的技术手段，而使用转肽酶（如sortases）进行蛋白质的催化标记已经成为一种受欢迎的选择。然而，这类酶面临的主要挑战之一是，大多数程序要求过量的标记试剂，或者使用活化底物，而不是简单商业购买的肽段。

        本文介绍了一种耦合酶策略，通过使用未活化的标记肽，实现了蛋白质N-和C-末端的定量标记。通过结合氨肽酶和转肽酶，实现了对多肽产物的序列特异性降解，平衡转移到有利于产物形成，极大提高了反应效率。随后的反应优化使得N-末端标记可以在多肽标记与蛋白质之间基本等摩尔比例下进行，而C-末端标记则只需要少量过量。减少用于定量标记的底物量有望改善工业过程，并促进将转肽作为蛋白质标记的方法。

标题：Quantitative N- or C-Terminal Labelling of Proteins with Unactivated Peptides by Use of Sortases and a D-Aminopeptidase

作者：Zoe L. P. Arnott, Holly E. Morgan, Kristian Hollingsworth, Charlotte M. E. Stevenson, Lawrence J. Collins, Alexandra Tamasanu, Darren C. Machin, Jonathan P. Dolan, Tomasz P. Kaminski, Gemma C. Wildsmith, Daniel J. Williamson, Isabelle B. Pickles, Stuart L. Warriner, W. Bruce Turnbull* and Michael E. Webb*

链接：https://doi.org/10.1002/anie.202310862