分享一篇2023年发表在ACS Sensors上的文章，题目是“Polarity-Driven Two-Photon Fluorescent Probe for Monitoring the Perturbation in Lipid Droplet Levels during Mitochondrial Dysfunction and Acute Pancreatitis”。文章的通讯作者是Centre For Interdisciplinary Sciences, JISIASR的Sankarprasad Bhuniya副教授。脂滴（Lipid droplet，LD）是非脂肪细胞中一种不常见的细胞器。它们经常出现在感染炎症的肿瘤细胞中，可以加速细胞信号传导、膜运输和脂质代谢。LD还积极参与细胞区室、蛋白质微阵列中脂质的秩序化，并充当炎症诱导介质。LD的合成发生在机体饥饿期间，在内质网中合成，线粒体中分解，为细胞功能提供能量。这一缓慢释放脂质的过程，起到缓冲作用，以抑制细胞应激。此外，在癌细胞中，LD促进侵袭、转移、血管生成、肿瘤促进炎症、避免免疫破坏和抵抗细胞死亡。因此，LD的信息对于了解细胞微环境紊乱，特别是在细胞应激和癌症预后中至关重要。近年来，双光子（Two-Photon，TP）荧光探针在活细胞和深部组织中无创检测LD的需求日益增加。Klymchenko等人使用TP荧光探针监测了细胞氧化应激和饥饿条件下血浆表面、细胞质、内质网和溶酶体的LD水平波动。在发现LD制造围脂滴蛋白后，人们已经确定LD动力学与线粒体、内质网和其他细胞器有关。这种分子机制为通过操纵LD动力学来可视化细胞器功能障碍开辟了新的视野。此外，根据能量需求，来自LD的脂肪酸在线粒体基质中通过β-氧化途径被氧化（图1a）。迄今为止，只有少数双靶向探针被用于同时研究线粒体和LD。鉴于此，我们开发了一种极性驱动的基于萘酰亚胺的TP活性荧光探针MLD-1，以将各种外源刺激诱导的线粒体功能障碍与活细胞中LD水平的波动联系起来。此外，我们还研究了探针的细胞定位、基于线粒体异常的LD形成变化及其TP特性。最后，我们首次尝试在离体小鼠模型中观察LD在胰腺炎症中的积累。
图1. （a）LD的功能：脂肪酸的储存和释放以及线粒体中游离脂肪酸的氧化。（b）截至2023年3月报道的LD和线粒体双靶向探针的化学结构。（c）LD和线粒体双靶向探针MLD-1的化学结构及其检测细胞器的机制。（d）MLD-1的合成方案。
MLD-1在水中荧光较差，但在二氧六环中有30倍强的发射（λem = 560 nm）（图2a）。以二氧六环为溶剂时，MLD-1的量子产率为0.85。MLD-1在常见的低极性有机溶剂中表现出较强的荧光信号，表明其具有溶剂致变色性质。另一方面，探头受粘度变化的影响最小，可以避免其他细胞器中与粘度相关的信号变化，从而获得高保真的脂质成像（图2b）。值得一提的是，传统的二甲胺供体基萘酰亚胺荧光团（例如，Ref-1）容易发生极性和粘度变化（图2c）。MLD-1中沿C-C键旋转的能垒（102 kcal）比Ref-1中沿C-N键旋转的能垒（48 kcal）要高得多（图2d）。因此，MLD-1中C-C键的受限旋转使其粘度不敏感。此外，含有萘酰亚胺衍生物的脂肪族叔胺（例如Ref-1）由于光致电子转移（PET）猝灭而荧光性差（图2c）。然而，MLD-1在二氧六环中表现出强烈的荧光，可能是由于叔胺对PET的低效猝灭。理论分析表明，MLD-1的发射性质由最高已占据分子轨道（HOMO）→最低未占据分子轨道（LUMO）跃迁决定（图2e），而负责PET猝灭的叔胺上的孤对电子位于HOMO-1。因此，PET在MLD-1中的猝灭在热力学上是不利的（−0.43 eV）。相比之下，Ref-1具有一个稳定的HOMO，减小了HOMO与HOMO-1之间的间隙（−0.07 eV），使得PET部分猝灭成为有利条件。由于规划结构，具有长烷基链的常规萘酰亚胺衍生物也容易发生聚集诱导猝灭（ACQ）。令我们惊讶的是，由于扭曲的苯环限制了分子间聚集，MLD-1似乎没有发生ACQ。因此，MLD-1中用于π延伸的额外苯环主要有助于减少粘度、PET和聚集猝灭的影响。
图2. （a）极性对MLD-1发射行为的影响。MLD-1在水和二氧六环中的发射光谱。插图：MLD-1在水和二氧六环中的灰度图像。（b）粘度对MLD-1发射行为的影响。MLD-1在水和甘油中的发射光谱。（c）MLD-1与同源化合物Ref-1的比较。（d）Chem 3D获得的MLD-1（沿C-C轴）和Ref-1（沿C-N轴）的旋转能图。（e）MLD-1和Ref-1的轨道能量图，解读PET猝灭的可能性。
为了了解细胞器分布，我们分别研究了MLD-1与Nile Red和MitoTracker Deep Red对LD和线粒体的共定位（图3a）。MLD-1与Nile Red和MitoTracker Deep Red均表现出良好的重叠[见图3a（A和B）中的放大合并图像]。高Pearson相关系数（PCCs）分别为0.90和0.95，表明MLD-1在LD和线粒体中都具有良好的共定位。含有脂肪胺的萘酰亚胺也被认为是溶酶体的靶标，为了研究溶酶体特异性信号串扰的可能性，我们还研究了MLD-1与LysoTracker Deep Red的共定位。低PCC值0.59表明MLD-1在溶酶体中的共定位不明显（图3a）。此外，我们使用DAPI和ER- tracker Red分别对细胞核和内质网进行了共定位研究。如预期的那样，MLD-1并没有定位到细胞核（PCC = 0.11），部分定位于内质网（PCC = 0.85）（图3a）。此外，我们观察到，随着二氧六环中含水量的增加，MLD-1的发射特性显著降低，当含水量（v/v）大于等于5%时，MLD-1几乎变为无荧光（图3b）。MLD-1可以在二氧六环介质中检测低至12.4 nM的水（图3c）。这就解释了为什么MLD-1在线粒体中的亮度相对较低，而在溶酶体中则没有荧光。LD是无水细胞器，使MLD-1具有强荧光。
图3. （a）MLD-1在HeLa细胞中的共聚焦荧光图像。（b）MLD-1荧光强度随二氧六环中水比（v/v）的增加而变化。（c）计算检测限度。
此外，我们进一步研究了线粒体应激过程中LD的形成。发现与对照组相比，线粒体应激细胞的PCC水平较低（图4）。饥饿条件导致产生最高水平的LD（PCC = 0.93），而H2O2、制霉菌素和顺铂对产生LD的效果一般（图4）。上述研究结果证实了线粒体功能障碍与LD水平升高密切相关。可能的原因是，损伤的线粒体因膜电位变化而无法产生ATP，从而促进LD的形成以实现细胞生长的能量稳态。因此，MLD-1可以作为监测线粒体应激诱导的LD形成的有效探针。
图4. 无营养饥饿、H2O2、制霉菌素、顺铂诱导的线粒体应激时HeLa细胞的共聚焦图像。
为了探索MLD-1的无创细胞和深部组织成像能力，我们评估了其TP特性。首先，获得了MLD-1孵育的HeLa细胞在740 ~ 1020 nm不同TP激发下的图像（图5a）。MLD-1在900 nm激发下TP活性最高（图5b）。然后，我们收集了900 nm TP激光照射后的通道分离荧光图像。如图5c所示，在500 ~ 650 nm处观察到强发射信号。在TP激发下的HeLa细胞放大图像中，LD和线粒体基质可以清晰分化（图5d）。MLD-1的TP细胞图谱在很大程度上依赖于细胞系的性质。例如，在富含脂质的HepG2细胞中，与LD水平相对较低的HeLa细胞相比，细胞发射最大值约为50 nm蓝移（图5e）。最后，我们还分析了MLD-1的深层组织穿透能力。将BALB/c小鼠心脏组织用10.0 μM MLD-1孵育1 h，在900 nm TP激发下成像，探针可以对60 μm深度的组织进行染色，表明MLD-1具有良好的组织成像能力（图5f）。
图5. （a）不同双光子激发下MLD-1孵育的HeLa细胞图像。（b）MLD-1的双光子激发相关发射强度分布图。（c）900 nm TP激发下MLD-1细胞图像。（d）MLD-1孵育的HeLa细胞在900 nm TP激发下的LD和线粒体基质图像。（e）900 nm TP激发下MLD-1处理的HeLa和HepG2细胞的双光子发射光谱。（f）900 nm TP激发下MLD-1对小鼠心脏组织穿透能力的监测。
胰腺炎是一种影响正常胰腺功能的炎症性疾病，在全球范围内，每年报道的胰腺炎病例约为900万例，使其成为最受关注的生物医学问题之一。迄今为止，许多LD探针已被用于研究疾病模型，如肝损伤，肿瘤，肌肉炎症等；然而，胰腺炎对器官内LD水平的影响尚不清楚。因此，我们将MLD-1应用于小鼠胰腺炎模型研究。为了建立急性胰腺炎模型，给小鼠注射游离l-组氨酸碱（4 g/kg剂量，间隔1 h腹腔注射2次）48 h后处死（图6a）。取肺、肝、肾、心、脾、胃、胰腺各脏器组织切片，用10.0 μM MLD-1处理1 h，清洗后用甲醛固定，TP显微镜下成像。结果发现，健康小鼠的肺、肝、肾和脾组织中LD含量较高，而胃和胰腺组织中LD含量可忽略不计（图6b）。胰腺炎期间，肝脏、肾脏和胃组织荧光强度升高，而肺和心脏组织荧光强度明显下降（图6c）。因此，除了分析胰腺的组织学外，l-组氨酸诱导的胰腺炎还可以通过测量肝、肾和胃组织荧光强度升高来表征。此外，我们还发现，在胰腺损伤的情况下，虽然荧光发射强度没有明显变化，但可以很清晰地观察到亮绿色荧光图像中LD的积累（图6d），这表明MLD-1有效地促进了胰腺炎组织中LD积累的跟踪。
图6. （a）l-组氨酸诱导的胰腺炎模型的构建及实验过程示意图。（b）各组小鼠的器官切片组织成像图。（c）健康小鼠和胰腺炎模型小鼠不同器官的相对荧光强度。（d）放大图像显示受损胰腺内LD的积聚。[ns （p > 0.1）, * （p < 0.1）, * * * * * （p < 0.01）, （p < 0.001）, * * * * （p < 0.0001）]。
综上所述，我们开发了一种TP活性极性驱动荧光探针MLD-1，具有双靶向LD和线粒体的能力。该探针具有良好的化学和光稳定性，在TP激发下具有明亮的荧光图像。由于其双靶向能力，该探针被用于研究线粒体应激对LD形成的影响。研究发现，大多数情况下，线粒体功能障碍会增强活细胞内LD水平。线粒体损伤引起的氧化磷酸化抑制似乎是观察到的LD积累以保持能量稳态的原因。最后，我们首次利用探针MLD-1研究了l-组氨酸诱导的胰腺炎对小鼠不同脏器中LD积累的影响。我们发现肝脏、肾脏和胃LD的升高可以作为检测胰腺炎的另一个特征。总之，本研究旨在探索应激条件下细胞和组织水平上LD-Mito的关系。结果表明，MLD-1有潜力被用作研究癌症生物学中LD-Mito相互关系的可靠探针。
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