Nat. Commun. | 活细胞表面的定点原位聚合

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分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章,题为Site-selected in situ polymerization for living cell surface engineering文章的通讯作者是来自南京大学的丁霖教授及南京工业大学的王晓剑教授。

    使用人工聚合物工程化哺乳动物细胞来操纵细胞的行为和功能,在生物技术及细胞治疗领域具有广阔的应用前景。不同于将聚合物附着到细胞膜表面的方式,Hawker等人首次以非共价方式将链转移剂插入到细胞膜表面,并启动可控自由基聚合,为细胞表面聚合物修饰的空间位阻问题提供了解决方案。然而目前的策略未能考虑到接枝位点对细胞的影响。
    本文中,作者尝试通过代谢标记与点击反应结合的策略,控制链转移剂在细胞表面的位置,从而实现聚合物定点修饰。
    首先如图1b所示,作者选择Jurkat细胞作为模型,进行氧化还原启动的可控自由基聚合反应,Fenton-RAFT。在合适的RAFT链引发剂存在下,利用Fenton试剂反应产生的高反应性羟基自由基进行N-2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体(HPMA)的可控自由基聚合。通过筛选聚合反应的培养基条件、反应时间、聚合体系组成等,作者最终将聚合时间设定为2分钟。同时为避免对细胞的损伤并保持对聚合的控制,单体转化率在30%左右。接下来,为控制聚合物的生长位点,如图1a,作者分别选择了四种代谢试剂,分别定位在细胞的聚糖、蛋白、脂质位点。
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1. 活细胞表面定点原位生长示意图

    聚合后细胞的扫描电镜图像显示出粗糙且蓬松的表面。使用可断裂链转移剂完成聚合后,解下的聚合物核磁特征峰与溶液中聚合物一致。另外,作者尝试将HPMA单体与功能性的丙烯酰胺-四乙二醇-生物素单体共聚。使用链霉亲和素-Cy3对细胞染色,荧光分布在细胞的表面。并且,使用特异性切割唾液酸的糖苷酶处理后,链霉亲和素-Cy3的结合信号降低66.5%,与糖苷酶的裂解率相符,表明聚合物确实在细胞表面的特定位点生长。
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2. 证明细胞表面定点原位聚合的实验表征

    随后,作者尝试探究聚合物在细胞表面的动态分布情况。作者将HPMA单体与丙烯酰胺-四乙二醇-叠氮单体共聚,再使用炔基-Cy5对细胞染色,然后孵育24小时。孵育后,聚合物滞留率大约在53.0%-76.3%聚合物在细胞膜上的减少可能是由于聚合物由于细胞增殖被稀释,或聚合物修饰的生物分子被胞吞/胞吐到细胞外。并且,由于聚合物在改变细胞膜上膜蛋白或脂质解离与再循环动力学上的差异,不同修饰位点的聚合物膜滞留能力有所差异。另外,通过STED超分辨成像,可见聚合物在细胞表面呈簇状连续分布,由于代谢标记在细胞上的均匀分布,作者推测聚合物不均匀分布的情况可能发生在聚合阶段,来自于邻近触发的协同聚合。
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3. 细胞表面聚合物保留情况

    接下来,作者从细胞活力保持、骨架结构、代谢能力、增殖能力、细胞内ROS水平等多个方面进行了细致地评价,表明聚合后细胞几乎未受到生物学功能方面的影响。
    随后,作者探究了聚合物生长位点对凝集素识别行为的影响。使用三种不同的FITC标记凝集素与细胞孵育,如图4e可以看出,从聚糖位点生长的聚合物对凝集素结合有非常显著的影响,亲和力下降,细胞的聚集被显著抑制。图4i为作者所提出的凝集素不同的结合机制。作者认为这一现象是由于细胞表面生长的聚合物作为天然糖表位之间的间隔物,使凝集素的多价识别更难发生。
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4. 聚合物生长位点对凝集素识别的影响

    肿瘤细胞能够通过分泌半乳糖凝集素辅助自身逃逸,从而抑制T细胞的完全活化并诱导T细胞生长停滞及凋亡。基于以上的结果,作者设想细胞表面的聚合物能够帮助抵抗这一行为。测定的凋亡率结果显示,两种聚糖位点修饰的细胞凋亡率显著降低(不超过11%)。这表明不同部位生长的聚合物表现出不同的T细胞保护作用,有望实现细胞功能的差异化调控,为免疫细胞的工程化和功能调控提供创新的方法。
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5. 不同位点生长的聚合物对T细胞介导的细胞凋亡的影响

    综上所述,本文中,作者开发了细胞相容的Fenton-RAFT聚合技术,并进一步通过代谢标记在活细胞上建立了选择性原位聚合平台。并且发现聚合物的生长位点对聚合物在细胞表面的保留时间及聚糖与凝集素的多价作用有不同的影响,这为免疫调节提供了新途径。

作者:ZRC
DOI: 10.1038/s41467-023-43161-x
Link: https://www.nature.com/articles/s41467-023-43161-x

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