作者团队在先前的研究中发现，全局去除细胞表面唾液酸影响了BCMA的表面保留和细胞存活。为了研究N-糖基化在BCMA表面保留中的作用，作者团队将野生型BCMA（WT-BCMA）和糖基缺失型BCMA（N42A-BCMA）分别克隆到质粒中，并在293T细胞中表达。流式细胞术显示，WT-BCMA和N42A-BCMA都表达在细胞表面，但N42A-BCMA的表面表达水平远低于WT-BCMA，而这些细胞中BCMA mRNA的水平相似。接着，作者团队使用逆转录病毒质粒pGCIRES-YFP在293T细胞中表达BCMA，并使BCMA和YFP从同一mRNA中翻译，因此可以根据YFP荧光强度估计BCMA的表达水平。符合预期的是，与N42A-BCMA细胞相比，WT-BCMA细胞上能检测到更多的表面BCMA。通常，BCMA由浆细胞系表达，因此作者团队也通过逆转录病毒将这些质粒转染到多发性骨髓瘤（MM）细胞系中，并通过YFP分选细胞，以查看在H929和RPMI8226等细胞系中是否可以观察到相同的现象。转染后，WT-BCMA和N42A-BCMA细胞中表面BCMA水平均有所增加，但在WT-BCMA表达细胞中的增加更多。这些结果表明，没有N-糖基化，BCMA的表面表达降低（图2）。

图2. 缺失糖基化的BCMA在膜表面的存量下降

为了探究N-糖基是否影响BCMA的表面保留，作者团队使用环己酰亚胺（CHX）抑制新蛋白质的合成，并观察了表面BCMA的变化。在CHX存在的情况下，H929和RPMI8226细胞中的表面BCMA水平相似或略有降低。当细胞被同时用CHX和PNGaseF处理以水解N-糖基时，表面BCMA水平显著降低，而BCMA的保留率也低于其他两组。然而，PNGaseF也可能作用于其他糖蛋白，并导致假阳性结果产生，因此作者团队尝试通过在使用CHX的情况下比较WT-BCMA和N42A-BCMA细胞上BCMA的表面保留来确认这一发现。流式细胞术分析显示，在N42A-BCMA细胞中，表面BCMA显著减少，而在对照组与WT-BCMA细胞上，表面BCMA仅略有下降。总的来说，这些观察结果表明，BCMA上的N-糖基提高了其表面保留（图3）。

BCMA是一种单通道跨膜蛋白，并且可在人类血清中检测到。因此，作者团队收集了培养基并测量了可溶性BCMA的浓度。研究人员发现，在H929和RPMI8226的培养基中可以检测到可溶性BCMA，但在293T细胞中却没有。但在转染后，研究人员注意到可溶性BCMA可在293T细胞培养基中被发现，且在N42A-BCMA细胞的培养基中能检测到更多的可溶性BCMA。转染了N42A-BCMA的H929和RPMI8226细胞也表现出相似的模式。由于BCMA是一种跨膜蛋白，当它的C-末端带有FLAG标签时，ELISA实验可通过针对FLAG的抗体来检测全长的BCMA蛋白。然而，ELISA实验中捕获到的全长BCMA蛋白数量极低，甚至接近对照组。

由于非糖基化的BCMA在培养基中表现出弱化的表面保留能力，作者团队推测，BCMA可能被释放到细胞外空间中。为了探究这一可能性，作者团队从转染WT-BCMA的H929和RPMI8226细胞培养基中纯化了可溶性BCMA，并进行了质谱分析。结果表明，来自H929和RPMI8226的WT-BCMA肽段大多是BCMA细胞外结构域的一部分，而非细胞内结构域。这个结果与ELISA实验的结果共同支持了可溶性BCMA是截短体的猜想。为了检验糖基化的存在，作者团队将可溶性BCMA与EndoS和EndoH一起孵育，以将甘露型N-糖基修剪到GlcNAc-Fuc糖基形式供质谱分析。结果表明，H929和RPMI8226来源的可溶性BCMA中拥有高百分比的非糖基化肽段。作者团队还研究了从293T细胞中纯化的可溶性BCMA，并发现在PNGaseF处理后的免疫印迹上没有条带漂移，说明该BCMA不携带糖基化修饰。综上所述，研究人员认为培养基中的可溶性BCMA以非糖基化和截短形式存在（图4）。

在先前研究中，BCMA被鉴定为γ-分泌酶的底物。考虑到γ-分泌酶能够分解具有短胞外结构域的膜蛋白，它可能负责可溶性BCMA的产生。γ-分泌酶的活性可以被抑制剂阻断，因此作者团队选择了两种γ-分泌酶抑制剂（GSI），DAPT和RO4929097，来处理细胞并监测表面BCMA的变化。结果显示，两种GSI都可以增加癌细胞表面BCMA的表达量。尽管在GSI处理后，N42A-BCMA细胞中表面BCMA的水平仍然低于WT-BCMA表达细胞，但N42A-BCMA细胞的BCMA增加程度显著高于WT-BCMA细胞。GSI对保护表面BCMA免受γ-分泌酶裂解的效果可以保持很长时间，在3天后都没有明显变化。作者团队还使用转染了WT/N42A-BCMA的293T细胞来确认这一发现，并观察到了相同的结果。由于GSI处理可以增加表面BCMA，作者团队也研究了GSI是否可以增加N42A-BCMA细胞或经过PNGaseF处理的细胞的表面BCMA的留存。符合预期的是，GSI的确增强了细胞表面BCMA的保留能力。这些结果表明，抑制γ-分泌酶活性可以维持非糖基化的BCMA在细胞表面的水平。此外，作者团队发现在存在GSI的情况下，293T、H929和RPMI8226培养基中可溶性BCMA的水平减少，而WT和N42A-BCMA细胞之间残留BCMA的量相近（图5）。

由于GSI可以抑制非糖基化BCMA的分泌并增强BCMA在经过PNGaseF处理的细胞或N42A-BCMA细胞表面的保留能力，作者团队希望进一步探究非糖基化的BCMA是否是γ-分泌酶的首选底物。用抗-FLAG抗体进行的免疫印迹分析显示，来自受GSI处理的WT-BCMA和N42A-BCMA细胞的BCMA表达模式相似。而在GSI处理后，WT-BCMA细胞中非糖基化的BCMA增加，而糖基化的BCMA没有显著变化。研究人员在N42A-BCMA细胞中也观察到了相同的现象。用抗-BCMA抗体进行的印迹显示了相同的结果。作者团队还发现GSI处理能增加两种癌细胞系中非糖基化BCMA的水平，而糖基化BCMA的数量增加则较少。这些结果共同表明，没有N-糖基化的BCMA更倾向于被γ-分泌酶从细胞膜上分解（图6）。

N-糖基化通常发生在N-X-S/T序列中。因此，作者团队突变了WT-BCMA的糖基化序列YCNAS为WCNGT（WCNGT-BCMA），并在293T细胞中表达WT和突变的BCMA进行比较。免疫印迹显示WCNGT-BCMA更多地被糖基化，而在WCNGT-BCMA细胞中检测到的表面BCMA也比WT-BCMA细胞更多。另一方面，来自WCNGT-BCMA细胞的培养基中的可溶性BCMA水平明显低于来自WT-BCMA细胞的水平。随后，作者团队用GSI处理了这两个细胞系，并发现WCNGT-BCMA细胞表面的BCMA有所增加，但增加程度比WT-BCMA细胞要少。这些数据支持了BCMA的N-糖基化抑制了γ-分泌酶介导的分解和分泌（图7）。

考虑到BCMA的主要功能是保护细胞免受凋亡的影响，因此作者团队探究了增加非糖基化BCMA对凋亡刺激的影响。研究人员首先使用地塞米松（DEX）诱导非表面受体依赖的细胞凋亡，并添加BCMA配体（APRIL或BAFF）来挽救细胞。结果表明，使用GSI处理的细胞对DEX诱导的细胞凋亡表现出比对照组更强的抵抗力。作者团队还使用另一种药物TRAIL来诱导受体依赖的细胞凋亡。与之前的结果类似，GSI处理的细胞对TRAIL介导的凋亡表现出比对照组更强的抵抗力。值得注意的是，GSI处理的细胞的凋亡率低于未经BCMA配体处理的对照组细胞，并且添加外源配体能进一步降低凋亡率。由于肿瘤细胞可以通过自分泌或旁分泌途径产生配体来维持其生存，探究人员发现可溶性APRIL配体在H929和RPMI8226培养基中均能被检测到，并且在细胞经过GSI处理后浓度降低。由于BCMA的N-糖基位于富含半胱氨酸的结构域附近，该结构域对配体结合至关重要，因此作者团队也探究了细胞表面非糖基化BCMA的异常相互作用是否导致细胞生存能力的增强。结果表明，在没有外加配体刺激的情况下，GSI处理的细胞中可检测到BCMA二聚体，而在未经处理的细胞中则没有出现这一现象。另一方面，非糖基化的BCMA单体在与BS3交联后有所减少。研究人员也使用了N42A-BCMA细胞并发现在用交联试剂BS3处理后，在N42A-BCMA细胞中可检测到BCMA的三聚体形式。这些结果表明，非糖基化的BCMA与二聚体或三聚体的形成有关，且细胞的生存受到自分泌配体的调控（图8）。

综上所述，作者团队发现分泌型BCMA是非糖基化的，γ-分泌酶的抑制会导致非糖基化BCMA在细胞表面的积累。此外，通过修改糖基位点序列提高BCMA的糖基化水平可以增加其在细胞表面的保留并减少可溶性BCMA的出现。由于BCMA的N-糖基位于跨膜结构域附近，作者团队认为BCMA上的N-糖基充当了调节γ-分泌酶对于BCMA可及性的守门员。由于BCMA的N-糖基位于CRD2结构域附近，它可能参与二聚体的形成。基于此，作者团队提出了一个模型，即GSI处理提高了细胞表面非糖基化BCMA水平，并促进BCMA的二聚体或三聚体形成，从而增强它与BCMA配体的结合，并在自分泌或旁分泌配体存在的情况下促进细胞免受凋亡的威胁。这项发现为B细胞相关肿瘤的治疗提供了新的思路（图9）。