分享一篇发表在Nat.Chem.上的文章，文章的题目是“Lysineacylation using conjugating enzymes for site-specific modification and ubiquitinationof recombinant proteins”，通讯作者是来自瑞士苏黎世的瑞士联邦理工学院（ETH），担任有机化学实验室的正式教授JeffreyW. Bode。其课题组致力于研究合成目前传统合成方法无法企及的分子和结合体，制备蛋白质、番茄红素、序列和长度控制的聚合物等分子，以及这些大型结构（MW > 5，000）的共价结合和需要新一代的化学反应。由于酶的特异性和温和的反应条件，酶是蛋白质标记的有力工具。然而，许多protocols局限于蛋白质末端的修饰，依赖于非肽代谢物或需要较大的识别域。泛素化系统可以说是蛋白质内位点结合的最重要的细胞途径,文章报告了一种化学酶的方法-赖氨酸酰化使用结合酶(LACE)，以位点特异性地修改折叠蛋白质在内部赖氨酸残基。LACE依赖于一个最小的遗传编码标签(四个残基)，由E2小泛素样修饰物偶联酶Ubc9识别，肽或蛋白质硫酯。总之，这种方法避免了E1和E3酶的需要，使Ubc9以可编程的方式形成异肽。同时通过生化探针的位点特异性连接，结合分类酶的一步双标记，以及野生型泛素和ISG15与重组蛋白的结合，证明了LACE的实用性。 作者首先为了避免E1酶对ATP依赖的激活的需要，使用短肽硫酯作为酰基供体作为硫酯连接的E1中间体(Ubl~E1)的最小类似物(图1a)。研究发现sumo衍生的肽硫酯通常表现出较低的反应活性，而泛素衍生的肽4表现出令人惊讶的高反应活性，并依赖于Ubc9，且三肽RGG被发现是提供可接受转换的最小肽。图1a：使用Ubc9和肽硫酯而不是E1硫酯作为酰基供体的异肽标记策略。使用模型底物ranGAP1评估肽硫酯的反应性，该底物包含一个四残留一致sumo酰化基序LKSE。受体赖氨酸K(蓝色)和酸性残留物E(红色)被突出显示。在N端用硫丹胺B修饰肽。 随后，作者测试了Ubc9的非典型底物是否可以与RanGAP1相同的方式进行修饰，发现当15 μM的这种GFP变异(GFP-C)与60 μM的Ubc9和150 μM的肽硫酯4在pH 7.6和30°C反应4 - 8小时时完全转换(凝胶密度测定>95%),反应严格依赖于Ubc9及其活性位点残基C93，以及标签的受体赖氨酸K6。为了测试最小序列IKXE是否足够，作者使用截断的LACE标签IKQE对GFP衬底进行标记,观察到半衰期约为3.0 h的完整和特异性标记。同时，异肽标记提供了在蛋白质序列中定位标签的可能性，除了C端，LACE标签被嵌入到GFP内部(GFP-i)或附着在N端(GFP-N)。当然，作者在研究泛素衍生肽与SUMO衍生肽的反应效率中，发现Ubc9比SUMO衍生物加载和转移泛素衍生肽的速度更快。图2a：Ubc9介导的GFP-C标记肽硫酯4。右:LACE标签序列，疏水残基Ψ(粗体)，受体赖氨酸K(蓝色)和酸性残基E(红色)突出显示。 接下来，作者为了评估LACE是否可以与其他化学酶方法结合，以实现特定的异功能化，同时又因为异肽标记可直接实现多个位点的偶联，因此，作者首先制备了一个包含两个LACE标签的GFP变体（一个在内部，一个在C端(GFP-i-C)），并准备了一个包含最小LACE标签(IKSE而不是LSSE)的SpyCatcher变体。SpyCatcher变体与SpyTag融合到麦芽糖结合蛋白(SpyTagMBP)进行有效连接，并在Ubc9和硫酯4的存在下直接标记，以获得一个三部分异肽缀合物（图3b）。同时，作者为了测试LACE与转肽酶sortase的结合，在曲妥珠单抗抗原结合片段(Fab)的轻链上安装了一个LACE标签，在重链上安装了LPETGG的排序标签(图3c)，流式细胞技术分析证实，异功能免疫偶联物对her2阳性癌细胞保留了预期的特异性。图3b：一个SpyCatcher变种(灰色)包含一个最小的LACE标签(IKSE而不是LSSE)与SpyTagMBP(黑色)在室温下1小时的反应，然后用噻酯4标记LACE. 3c:一步双标记曲妥珠单抗Fab，在Ubc9和SrtA7M存在的情况下，轻链上有LACE标签，重链上有LPETGG分类标签，硫酯4(红色)和甘氨酸香豆素探针20(浅蓝色). 最后，鉴于Ubc9更倾向于泛素C端对应的酰基供体，所以作者假设它应该很容易转移全长泛素。为了验证这一点，作者通过相应的GyrA intein融合的巯基乙磺酸盐(Mes)泛素硫酯(Ub-Mes, 22)的硫解制备重组C端2-巯基乙磺酸盐(Mes)泛素硫酯(Ub-Mes,22)，并进行GFP-I的LACE反应，发现在24小时内观察到82%转化为GFP-Ub共轭物，并发现Ubc9可以通过引入赖氨酸受体周围的适度变化，有效地修饰底物中的特定位点，并在折叠条件下实现整个蛋白质的偶联，总而言之，Ubc9影响重组蛋白的位点特异性泛素化和ISG15化。同时通过x射线晶体学进行结构研究，确定Ubc9 -泛素肽复合物的结构显示为封闭构象。 LACE利用迄今为止开发的最小的识别标签之一，用于此类特定标签,Ubc9只需要最小的LACE标签(IKXE)，并可以在一些野生型基质上进行定点功能。通过引入受体赖氨酸周围的适度变化，Ubc9可以有效地修饰蛋白质中的特定位点。虽然嵌入二级结构的LACE标签的反应性有限，但由于没有特定的二级结构要求，可以直接将LACE标签合并到非结构化区域、环路和融合到N或C端的标签中。同时泛素衍生肽作为sumo结合酶Ubc9的酰基供体的惊人熟练程度，因不需要E1酶，为利用LACE进行一步泛素化和ISG15化提供了可能性，拓宽了有待研究的蛋白质范围。总之，LACE可作为一种在内部位点生成蛋白质偶联物的简单方法。短的、遗传编码的LACE标签、广泛的底物耐受性和灵活的修饰位点使Ubc9介导的过程成为一种独特的、易于执行的方法来获取异肽蛋白偶联物。原文链接：http://www.nature.com/articles/s41557-020-0528-y原文引用：doi.org/10.1038/s41557-020-0528-y
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