分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题为Quantitative N- or C-Terminal Labelling of Proteins with Unactivated Peptides by Use of Sortases and a d- Aminopeptidase。文章的通讯作者是来自英国利兹大学的W. Bruce Turnbull教授及Michael E. Webb教授。
蛋白质的位点特异性修饰被广泛应用于学术界及工业界，使用转肽酶如分选酶（Sortase, SrtA，识别序列为LPXT/G）提供了有效的N端或C端修饰策略。这类酶使用时的一大挑战在于反应存在平衡，在热力学控制下体系中同时存在修饰产物与未修饰产物的混合物，如图1AB所示。同时，分选酶的底物识别序列、初始硫酯中间体形成时的副产物都仍然存在于体系中。为解决这一问题，实现完全转化，通常需要过量的修饰试剂或从反应混合物中去除未修饰的蛋白质。尽管存在许多改进的策略，例如图1C中使用缩肽作为底物，使副产物不再是酶的底物，但这一方法仅适用于N端修饰。又如图1D中，使用高浓度Ni2+螯合副产物肽。然而，能够使用转肽酶实现定量修饰的通用策略极为有限。图1.转肽酶蛋白质修饰反应过程示意图 在本文中，作者设想在反应中引入第二种酶，使其选择性地降解特定的肽副产物，将其从反应平衡中去除，促进平衡向有利于产物生成的方向移动，如图1E所示。作者发现来自于人黄杆菌的D-氨基肽酶（DAP）是合适的选择，它作用于N端为D氨基酸或甘氨酸的多肽。 首先，作者筛选了DAP的底物特异性。如图2A所示，作者构建了GXSKYG的多肽库，加入DAP进行孵育，并使用LC-MS进行产物分析。可见，A, D, E, G, M, N, Q等能够完全水解，而以GV或GP为末端的肽是最差的底物，绝大部分不能被水解。 由于DAP对底物肽中第二残基存在选择性，通过设计反应中两个底物LPETGX1和GX2的序列，就能够直接实现上图1E中的设计。具体来说，反应底物GX2不能被DAP水解，而反应产物GX1则需要被DAP识别。由此，作者选择C端带有LPETGA序列的模型蛋白PanZ进行修饰实验，并加入2当量的GVSKYG多肽。由图2B，加入DAP后，产物的比例由50%提高至80%。图2.筛选D-氨基肽酶的底物序列选择性 随后，作者尝试优化标记反应的条件，对霍乱毒素亚单位CTB-LPETGASH6。在加入DAP及2当量的GVSKYG多肽后，实时监测标记反应，如图3A所示，反应在约2小时后观察到>95%的修饰率。图3BC则反映出，将修饰肽的当量降低至1.5时也能够得到相近的结果。以上都说明这一方法能够实现有效的C端修饰。图3.筛选反应条件以实现定量标记 接下来，作者尝试对GVG-CTB进行N端修饰。加入DAP及1.2当量的AYLPETGG多肽后，实时监测标记反应，如图4所示，相比于不添加DAP，修饰率由50%提高至接近100%，在两小时内实现了近定量标记。图4.优化N末端蛋白质修饰效率 考虑到添加及去除两种酶增加了产品污染的可能性，并且单一试剂更容易处理及监测，作者尝试将分选酶与氨肽酶的两种活性合并，构建了融合蛋白SrtH7D。首先，如图5A-D所示，通过模型蛋白的C端及N端修饰，作者发现融合蛋白能够同样有效地完成修饰，无需进一步优化。 随后，作者对一个适用于N/C双端修饰的蛋白（TEV-GVG-I27-LPETGAH6）进行了实验。首先，加入2当量的修饰肽以及SrtH7D，2小时内能够得到C端修饰的蛋白。在tev酶切暴露出N端GVG序列后，使用正交的缩肽策略，能够得到双修饰的蛋白，顺序的过程如图5E所示。 图5.使用融合蛋白实现双酶功能整合 在完成对高效N/C端标记的证明后，作者进一步对三个方面的问题进行了探究。首先，作者尝试通过降低温度，即4℃下反应，减少副反应水解产物。如图6F所示，尽管反应速度变慢，但过夜孵育后，蛋白质修饰效率提高至>99%，水解产物减少。另外，如图6G所示，具有不同底物特异性的分选酶变体也能与DAP结合使用，实现肽的定量修饰，表明该方法的可迁移性。最后，使用模型蛋白Aff-LPETGA及GVG-MBP，作者尝试使用SrtH7D实现两种蛋白质的融合。如图6H所示，在4℃下反应7天后，反应原料之一几乎完全消耗，表明成功的蛋白融合。 图6.优化蛋白质修饰过程 综上所述，本文中作者发现，联合使用分选酶与D-氨基肽酶，能够序列特异性地降解肽副产物，促进修饰反应的平衡向产物生成方向移动。在使用少量的标记肽的条件下，实现蛋白质N端或C端的定量修饰。 作者：ZRCDOI: 10.1002/anie.202310862Link: https://doi.org/10.1002/anie.202310862
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