给大家带来一篇nature chemistry上的文章，文章通讯作者是来自瑞士苏黎世联邦理工学院，化学和应用生物科学系的Jeffrey W. Bode，他的课题组研究方向是合成有机化学，蛋白质偶联、蛋白质化学合成等。

    蛋白质酶法标记具有高特异性，并且所需反应条件温和，故而成为有力的标记工具，但是其缺点是仅限于蛋白质末端修饰，而且依赖于非肽类代谢物，并且需要较大的识别域。本文报道了一种化学酶法，使用一种赖氨酸酰化结合酶（LACE），即E2酶Ubc9，无需E1和E3酶，可以将特定序列肽段修饰到蛋白赖氨酸上。作者将该策略应用到了定点引入生化探针实验；以及与其他种酶标记策略混合使用，实现正交一锅双标记；以及实现ISG15蛋白和泛素(Ub)连接，得到重组蛋白。

    本文发展的LACE策略由三部分组成，一是酶Ubc9，二是硫酯肽段donor，三是4个特定氨基酸组成的一个标签。反应过程就是酶Ubc9特异性识别底物上的标签，然后将donor上的硫酯键断开，将肽段修饰到标签上的氨基酸残基上。

     作者研究首先起源于关注了Ubc9酶，它是一种催化SUMO修饰到底物上的酶，其功能类似于E2,，但是在无E3存在时它也能直接将底物连接SUMO修饰，即将“E1-硫酯键-SUMO”结构连接到底物上。并且要求其底物具有特异性的序列肽段ΨKXD/E，（其中ψ是疏水残基，K是要修饰的赖氨酸，X是非保守残基，D/E是酸性残基），Ubc9酶必须特异性识别该序列才能完成催化反应。所以作者就设想，可以将“肽段-硫酯-R”用来模拟“E1-硫酯键-SUMO”，从而被Ubc9识别进而连接到底物上。作者首先在一个Ubc9模型底物上，通过与不同硫酯肽（肽段部分为Ub或者SUMO的C端肽段）反应，通过肽段上所连接的荧光染料来定量。作者确认了反应的高效性并筛选得到了反应性最好的硫酯肽作为“donor”。接下来作者又换不同底物来测试反应，将几种包含ΨKXD/E序列的底物肽段分别融合表达到GFP的C端，然后与前文筛选的donor反应，作者发现反应性都很好，半衰期1.3h，而把肽段融合到GFP的中部和N端，半衰期分别为1.2h和3h。突变试验证明了底物肽段上的K和E的必须性，以及酶Ubc9第93位半胱氨酸的必要性。荧光染料还可以被替换为生物素等。作者发现Ubc9对于Ub衍生肽段催化修饰能力强于SUMO衍生肽段。作者又将此方法与其他两种酶法连接结合使用，发现具有很好的正交性。由于前文介绍Ubc9对于ub衍生肽段具有更好的效率，所以作者期待它可以将整个泛素链接到底物上，所以作者将泛素C端连接硫酯得到2-巯基乙磺酸泛素硫酯（Ub-Mes），然后试着将它催化转移到底物上，发现在24h内效率可到80%。作者又改造了其他一些修饰的结构的结构，例如干扰素刺激基因产物15（ISG15），它具有和Ub相同的C端，所以把它C端连接硫酯然后修饰到α-突触核蛋白的96位赖氨酸上。最后作者解析了Ubc9和Ub肽段结合的晶体结构，确认了异肽处于关闭构象，这对于Ubc9催化泛素转移过程非常重要。

    总之，作者实实现了对特定底物蛋白的特异位点酰基化修饰，修饰位点可位于蛋白内部，而酰基化修饰部分可以是肽段、探针或者泛素等。

本文作者：ZYL

责任编辑：LZH

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-020-0528-y.pdf

原文引用：DOI：10.1038/s41557-020-0528-y