分享一篇发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，文章的通讯作者是加州大学旧金山分校的Lei Wang教授，Wang教授的研究方向主要是通过基因编码技术将非天然氨基酸掺入到蛋白质中，用于蛋白质的功能研究以及新生物学疗法的开发。

       官能团在蛋白质上的定点修饰为蛋白质工程研究提供了非常有力的工具。在本文中，侧链上携带光笼分子和醌甲基化物（QMs）的非天然氨基酸FnbY（邻2- 硝基苄基-β- 氟酪氨酸）和FmnbY（邻2- 硝基苄基-3- 氟甲基酪氨酸）通过基因工程的方法被定点插入到目标蛋白中。只有在紫外照射条件下，FnbY和FmnbY上才会分别产生有活性的p-QM和o-QM，激活后的QMs可以迅速与炔烃，叠氮，烯烃等胺衍生官能团连接，进而将修饰或者探针定点连接到蛋白上。FnbY激活产生的p-QM可以在β-碳位发生迈克尔加成反应，与蛋白骨架的距离比o-QM更近。连接距离是一个比较容易被忽视的因素，但是在较精密的实验中短的连接距离可以尽可能地减少由于linker的灵活性而产生的干扰。

       作者分别用这两种非天然氨基酸标记了泛素分子（Ub），麦芽糖结合蛋白（MBP），给它们带上荧光素和生物素的标签，并测试了两种非天然氨基酸在不同缓冲液中的标记效率，FnbY通过p-QM得到的标记效率在65%到67 %之间，FmnbY通过o-QM的产生标记的效率则几乎接近100 %。以上结果说明o-QM比p-QM具有更高的反应活性，这可能是由于β-碳位的空间位阻较大造成的。随后，作者评价了该方法的标记速率，发现在10min左右的时候标记可以达到饱和状态，证明本方法具有较快的反应速度，不会对细胞生长产生明显影响。同时作者还比较了在不同温度下（室温，4 ℃，0 ℃）条件下的标记效率，发现在低温下的标记效率与室温几乎一致，因此本标记流程可以低温进行以保证蛋白的稳定性。

      蛋白的定点自旋标记结合EPR/DEER策略可以用于蛋白质的结构动力学以及蛋白相互作用的研究。FnbY的一个优点是能够在β-碳位产生连接，使自旋标签能够连接在与蛋白骨架最近的位置，从而减少干扰。本文将FnbY标记到T4 溶菌酶的Ile9和 Val131位点上，两个标签之间的距离与晶体结构的距离基本吻合，说明较短的连接可以得到更精确的结构测定结果。

       本文发展的标记策略具有位点特异性、快速、光可控性、低温兼容性、普适性强、与蛋白骨架连接距离最短等优点，有望成为蛋白质以及生命医学研究中的一种有价值的工具。

文章作者：XWD

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06820

原文引用：10.1021/jacs.0c06820