Chem. Sci. | 在细胞表面鉴定糖蛋白的凝集素临近氧化探针

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推荐一篇发表在Chemical Science上的文章,文章的题目是“Determination of the glycoprotein specificity of lectins on cell membrane through oxidative proteomics”。本文的通讯作者是来自加州大学欧文分校化学系的Carlito B Lebrilla教授,他们课题组的研究方向是在营养和疾病领域开发质谱分析工具。

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      细胞膜是由包括很多糖的缀合物组成的网络,这些缀合物主要是由糖蛋白和糖脂组成的。目前对这些糖的缀合物主要是通过体外的凝集素标记来研究的。而在细胞内,因为糖链介导的相互作用十分短暂并且不牢固。不仅如此,凝集素在细胞内特异性结合的靶点也不为人所知。所以很难用凝集素来研究细胞内的糖缀合物。由此,细胞多糖蛋白靶点的实际情况可能就被大大忽略了,所以不能体内标记的局限性严重影响了该方法的广泛应用。在本篇文章中,作者开发了临近的凝集素氧化标记的方法,从而更好地识别细胞表面的多聚糖。

该探针的具体原理是,首先在凝集素上引入一个叠氮基团,利用与二苯并环辛基-FeBABE(DBCO-FeBABE)反应的氧化标记作为探针来生成羟基自由基。当该探针在细胞表面时,凝集素附近的蛋白被羟基自由基氧化,随后,被修饰的氧化侧链通过被质谱表征,从而鉴定靶向蛋白。在本篇文章中作者一共用了8种凝集素来确定每种凝集素的特定糖蛋白靶点。

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      通过优化实验条件,作者发现50-300μM的过氧化氢浓度和30分钟的反应时间会在探针20 Å的范围内产生羟基自由基,这对于识别探针附近的蛋白质是最理想的。作者用3D嵌合蛋白质模型测定了大部分氧化位点都在25 Å的范围之内。

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      随后,作者在PNT2细胞系上进行了蛋白质组学的鉴定。其中70%的被氧化蛋白是已知的的糖蛋白。并且其中只有5%的蛋白不是糖蛋白。而通过分析一些已知位点的高度糖基化蛋白被氧化的位点发现,蛋白被探针氧化的位点都发生在糖基化位点的附近,该结果说明了该方法可以有效的识别特异性结合凝集素的靶蛋白。实验随后通过很多手段验证了该方法的准确性和灵敏性。

      最后作者将该方法应用到了两种不同的前列腺癌的细胞系中(LNCaP和PNT2)。实验发现两种细胞系对于不同凝集素的敏感性是不同的,作者认为该方法可以用来比较蛋白网络之间的关系。

      总之作者开发了临近的凝集素氧化标记探针,该方法可以有效地鉴定细胞内凝集素和糖蛋白的相互作用,提供细胞表面的蛋白靶点,并通过对特异性的氧化蛋白功能分析,提供由多糖介导的细胞膜表面网络。


文章作者:WYK

责任编辑:LZH

原文链接:https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/d0sc04199h#!divAbstract

原文引用:DOI:10.1039/D0SC04199H

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