分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章，题目为“Self-Assembled L–DNA Linkers for Rapid Construction of Multi-Specific Antibody-Drug Conjugates Library”。在本文中，作者构建了一个基于L–DNA的模块化ADC（MADC）平台，能够构建具有多特异性靶向、多特异性有效载荷和精确的药物抗体比率（DAR）的ADCs库。

抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates, ADC)是一种新型靶向化疗药物，包括三个核心成分：结合肿瘤相关抗原的抗体、细胞毒性有效载荷和它们之间的连接体。因其特异性靶向给药的方式，ADC在减轻化疗药毒副作用方面具有极大的开发潜力。然而，耐药性的频繁发生成为限制ADC临床成功的主要因素之一。引起耐药性的机制是多方面的，例如抗原下调、受体外结构域脱落或细胞外基质组分脱落等导致的表面受体的变化，或多药耐药泵（MDRP）对ADC释放的毒素的主动清除。克服耐药性的一个有效解决方案是设计能够靶向多个抗原表位或携带多种毒素的ADC。为了利用多特异性ADC的潜力，在过去几年中已经开发了几种创造性的方法，最突出的例子是使用生物正交点击化学、分支ADC接头和化学酶偶联来获得具有特定药物抗体比（drug-antibody ratio, DAR）的双药物ADC。在此基础上，本文开发了一个基于L–DNA的高度模块化平台，用于快速构建所有品种的多特异性ADCs，适用于高通量功能筛选。此外，这些具有L–DNA支架的ADC在体内表现出良好的治疗效果和安全性，有利于成为潜在的候选药物。

首先，本文设计了模块化ADC平台（MADC）。作者选择了体积小、结构稳定、便于酵母分泌表达和纯化的靶向抗原的单结构域抗体（sdAbs），并利用人造L–DNA寡核苷酸对抗体和药物进行了标记，通过碱基互补配对自发形成具有所需靶向和细胞毒性特征的同质ADC（图1）。此外，带负电荷的L–DNA可以降低ADC整体的疏水性，有利于降低药物的清除率，为高DAR的ADC的构建提供可能。

MADC的成功很大程度上取决于L-DNA寡核苷酸在环境温度（20-30°C）下准确组装的能力。L–DNA需要足够长，以形成Tm>50 °C的高度稳定的复合物，但组装的L–DNA复合物应不大于50kDa，以允许充分的肾脏清除。本文使用30–34个碱基对（bps）长度的寡核苷酸来组装四聚体，采用经典的Holliday junction结构，强制上下和左右镜像对称，以简化序列设计（图2a）。接着，本文进行了自组装的L–DNA序列的计算机辅助优化（图2b）。优化的四聚体序列的电泳分析显示，与手动设计相比，组装ADC更均匀（图2c）。

接下来，本文对MADC筛选结果进行合成验证。本文将游离半胱氨酸附加到sdAb C末端（命名为sdAb-Cys），并将5'-氨基附加到L–DNA的5'末端（命名为5'氨基-L–DNA），通过PEG化的SMCC双功能连接体将5'-氨基-L-DNA和sdAb-Cys连接（图3a）。随后，为了与有效载荷结合，本文合成了具有5'-和3'-氨基修饰的同源双功能L-DNA和具有5'-氨基和3'-硫醇修饰的异源双功能L–DNA。5'-氨基末端可以与活性酯连接体（OSu-Glu-vcPAB-MMAE）偶联有效载荷（图3b），而3'-巯基末端可以与马来酰亚胺基团（MC-vc-PAB-Duocamycin和MC-vc-PAB-MMAF）偶联有效载量（图3c）。结果发现，L–DNA在与已知ADC有效载荷的同源和异源双功能偶联中都表现良好。此外，异构体双功能L–DNA可用于分别与5'-氨基和3'-Cys末端偶联sdAb和payload（图3d）。

进一步，本文使用抗HER2IV-S3（用于癌症靶向）、抗HSA-S4（用于体内稳定性）、MMAE-S1-MMAE和MMAE-S2-MMAE（毒素有效载荷）模块，通过等摩尔比混合四个模块来快速组装DAR为4的抗HER2-MADC（药物A），并以不含sdAb的药物B、不含有效载荷的药物C和FDA批准的抗HER2的ADC（T-DM1）为对照（图4a-b），用乳腺癌细胞系HCC1954评价了MADC的体外细胞毒性。结果显示，药物A和T-DM1显示出相似的细胞毒性功效，而药物B显示出较低的细胞毒性，药物C不显示细胞毒性（图4b左）。接着，本文用pHrodoTM代替毒素MMAE构建了A-pHrodo、B-pHrodo、T-DM1-pHrodo，并进行了细胞内化测定。结果显示，A-pHrodo荧光信号随着孵育时间的增加而迅速增加，在2.5h后达到饱和强度；T-DM1-pHrodo信号增加慢得多，在20h后达到最大强度；B-pHrodo几乎信号没有增加（图4b，右）。随后，本文用三种癌症细胞系SK-OV-3、HCC1954和SK-BR-3验证不同DAR MADC的疗效，发现MADC的疗效与DAR值之间表现出相关性（图4c）,并进一步通过体内小鼠实验进行验证（图4d）。