各种细胞生理机制被细胞器之间的串扰通路精细地调节，它们的失调与不同的病理条件有关。为了全面系统地了解疾病的发病机制和治疗方法，对细胞器相互作用进行深入研究至关重要。然而，由于缺乏能够同时标记两个具有双重不同信号的细胞器的时间分辨分子工具，阻碍了研究人员在纳秒尺度上准确表征相互作用调控机制的能力，这为细胞命运的研究带来了障碍。为了研究活细胞中两个细胞器之间的相互作用，基于FLIM成像技术开发出能够同时区分两个细胞器的有效分子工具是关键和难点。内质网自噬是一种处理途径，其靶向内质网结构域，并将其隔离在自噬体中，以便在营养缺乏时运输至液泡或溶酶体进行降解。观察内质网(ER)和自噬体之间的相互作用调节机制需要细胞内部环境中的非侵入性、实时和可区分的信号以及高时间和空间分辨率。
图1（A）膜张力响应模式。（B）分子设计。（C）揭示内质网和自噬体调控机制的双荧光寿命成像示意图。
为了评估不同吸电子受体对吲哚啉分子转子旋转的影响，利用CFs通过FLIM成像直接监测不同种类单相GUV的荧光寿命。采用温和水合法制备了Ld GUV（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱：DOPC）和Lo GUV（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/胆固醇：DPPC/CL和鞘磷脂/胆固醇：SM/CL）。其中，已知胆固醇插入Lo相，填充DPPC或SM双键产生的自由空间，增加脂质有序和膜张力。此外，考虑到CF1和CF2的亲水性和疏水能力不同，选择两亲性SM GUVs和亲脂性DPPC GUVs作为脂质顺序微结构域。如图1，CF1和CF2在DPPC/CL或SM/CL GUVs中的荧光寿命普遍高于DOPC GUVs，这主要与胆固醇存在下双层膜张力增加有关。然而，基于与推拉系统中供体相同的吲哚啉分子转子，不同的吸电子受体在脂质有序和膜张力作用下影响了CF1和CF2的平均荧光寿命范围。如图1A，B所示，CF1在Lo和Ld GUVs中的平均荧光寿命几乎都以伪青色出现，对应于在1.312–1.742 ns范围内较短的荧光寿命。CF2 在由 DPPC/CL组成的 Lo 微结构域中表现出伪彩色黄色，对应于3.195 ns 的荧光寿命，或在 SM/CL GUV 中表现出2.590 ns 的荧光寿命。因此，这些结果表明，由于−BF2 具有很强的吸电子能力，CF2的荧光寿命比CF1对脂质排序更敏感。
图1. 用 5 μM CFs. （A） CF1 的FLIM 图像（a1–a3）染色的单相 GUV 中的 FLIM图像。（B） CF2 的FLIM 图像（b1–b3）。（C）CF1 和（D） CF2 在不同种类的 GUV 中的分布。
考虑到CF2可以通过两种不同的荧光寿命来区分Lo和Ld相，为了探索CF2是否能够识别混合相GUV中Lo和Ld微结构域的共存，从而实现不同膜张力的同步双荧光寿命成像。如图2所示，DOPC/DPPC/CL和DOPC/SM/CL GUVs的FLIM图像显示出清晰的分离结构域，同时具有绿色和红色两种不同的伪色。对于图2A中的DOPC/DPPC/CL GUV，记录了双指数衰减，衰减时间为τ1（0.899 ns） 绿色和 τ2（3.087 ns） 为红色。同样，它也符合 DOPC/SM/CL GUV 的双指数衰减，其中荧光寿命短 τ1绿色为1.066 ns，荧光寿命长τ2红色为2.342 ns（图2B）。此外，CF2在DOPC-DPPC-CL（2.369 ns）中的荧光寿命（2.369 ns）比在DOPC-SM-CL（1.497 ns）中更长，表明DOPC-DPPC-CL 的膜张力可能高于DOPC-SM-CL。
图2. 用5 μM CF2 染色的混合相 GUV 中的 FLIM图像。（A）DOPC/DPPC/CL 1.0：4.0：1.39体积比下CF2的FLIM图像。（B）DOPC/SM/CL 1.0：4.0：1.39体积比下CF2的FLIM图像。（C）图（b2）中DOPC/DPPC/CL GUV 的白框 ROI 1 和 ROI 2 的寿命直方图。（D）图（b2）中DOPC/SM/CL GUV 的白框 ROI 3 和 ROI 4 的寿命直方图。
此外，如图 2C 所示，DOPC/DPPC/CL GUV 中白框感兴趣区域 （ROI） 1 和ROI 2 的 FLIM 直方图拟合和分裂良好，表明 CF2 能够同时对不同的膜张力进行双荧光寿命成像。然而，如图2D所示，与DOPC/DPPC/CL GUV相比，DOPC/SM/CL GUV中白框ROI 3和ROI 4的FLIM拟合直方图分割不佳，这主要是由于CF2在Ld和Lo脂质微结构域中的荧光寿命相对较近。因此，CF2可以同时标记具有两种不同荧光寿命的混合GUVs，以响应不同的脂质微结构域，有望研究细胞环境中的膜张力。为了研究膜张力对CF2荧光寿命变化的影响，采用混合GUV（DOPC：DPPC：CL = 2：2：1）方法，采用CF2检测不同膜张力下的荧光寿命。改变膜张力的常用方法是施加渗透冲击。低渗透性休克可导致膜张力增加，而高渗透性休克可能导致膜张力下降。如图 3 所示，当对装有 CF2 的GUV 施加低渗透冲击 (Π = 0.3 Osm) 时，我们观察到低渗透冲击的寿命比在等渗条件下更长（Π = 0.3 Osm，等于 0.9% NaCl 溶液或 4.5% 葡萄糖溶液），但在高渗透冲击 （Π > 0.3 Osm） 下更短（图 3A，B）.平均荧光寿命的变化τi 与渗透压Π（R2= 0.9793），随膜张力的增强而增加。总体而言，平均荧光寿命τi的依赖性在两种GUV中，来自培养基的渗透压Π呈线性关系，斜率为−0.9248 ns Osm–1 (图3C）.平均荧光寿命τi的稳健变化与渗透压成正比的Π表明CF2的寿命与膜张力呈良好的线性拟合，可用于监测膜张力的变化。
图3. CF2 荧光寿命对用 5 μM CF2 染色的 GUV 的渗透冲击的响应。（A） GUV（DOPC/DPPC/CL GUVs）在等渗缓冲液（0.308 Osm）和低（0.034和0.154 Osm）或高渗透冲击（0.462、0.616、0.770、0.924和1.027 Osm）之后的FLIM图像。（B）图（A）GUVs的荧光寿命衰减。（C）平均荧光寿命 τi 作为施加在GUV上的渗透压Π的函数。
CF2 在不同的膜张力下具有两种不同的荧光寿命，并且可以同时显示内质网和自噬体，假设 CF2 可能能够通过 FLIM 同时可视化内质网和自噬体利用两个细胞器之间的不同膜张力。由于自噬体的时空分布受细胞营养状态的精确调控，因此，将细胞在无血清培养基EBSS中孵育，刺激饥饿下细胞中自噬体的过表达，细胞中自噬体的含量显著增加1 h。如图4A-a1所示，基于内质网和自噬体中荧光强度信号的共聚焦图像都发出了红色荧光，无法区分两种不同的颜色，也无法同时显示内质网和自噬体之间的相互作用。与CF2一起孵育的3T3细胞的FLIM成像显示，内质网和自噬体同时具有双荧光寿命（图4A-a2）。如图4A-a3，a4所示，CF2的荧光寿命与双指数衰减拟合，得到平均荧光寿命τ1的衰减为0.702 ns荧光绿色，其他平均荧光寿命衰减 τ2为1.834 ns红色荧光，荧光寿命值超过2倍。伪绿色代表较短的荧光寿命，这清楚地描绘了内质网的肾小管和层。伪黄色对应于更长的荧光寿命，这说明了空心球状和新月形的自噬体。如图4B 所示，ROI 1 （ER）的荧光寿命 τ 为1.649 ns，ROI 2（自噬体）的荧光寿命τ 为 1.902 ns。如图4C所示，在590–650 nm的发射范围内收集了3T3细胞中ER和自噬体的共聚焦3D图像，两者之间的荧光强度差异很小，增加了从空间角度区分两个靶标的难度。然而，如图 4D，CF2 的3D FLIM 清楚地揭示了内质网和自噬体的空间分布，这可能为从时空角度同时可视化内质网和自噬体之间的相互作用提供了机会。
图5. 用5 μM CF2 染色的 3T3 细胞中与运动自噬体偶联的动态 ER 小管的 FLIM 成像。白色框架标记了与运动自噬体偶联的动态内质网小管的位置。红色星星标记了内质网小管和自噬体的三向连接。（D）图（d1-d3）中与运动自噬体偶联的动态内质网示意图（绿色：ER;红色：自噬体）。（E） 内质网小管生长图，用于连接自噬体的生长尖端（N = 6;平均值：2.503 μm）。（F）新形成的自噬体偶联内质网小管伸长期的持续时间图。
为了研究自噬在与内质网应激相关的细胞凋亡过程中的作用，使用CF2通过FLIM可视化顺铂诱导的3T3细胞中内质网与自噬体之间的相互作用。如图6A所示，在顺铂刺激1 h期间，可以清楚地观察到空心球形自噬体和网状内质网的形态，并且自噬体均匀分布在管状内质网区域周围。随着孵育时间增加到5 h甚至15 h，自噬体数量急剧增加，ER破碎成短杆或球状。24 h后，细胞完全凋亡，自噬体与内质网融合形成空心囊泡（ROI 1和ROI 2的白色箭头），发生内质网自噬。在图 6B 中，ROI 1 的荧光寿命为 1.590 ns，ROI 2 的荧光寿命为 1.829 ns，能够定量 ER 和自噬体的融合。此外，平均荧光寿命τ我随着顺铂孵育时间的增加而增加（图6C）。此外，随着顺铂孵育时间的增加，寿命较长的比例逐渐增加，寿命较短的群体相应减少（图6D和）。这些结果表明，过长和强烈的内质网自噬导致自噬体与内质网融合，从而促进了内质网相关的自噬凋亡途径。综上所述，3T3细胞中CF2的FLIM成像显示，在顺铂诱导的细胞凋亡途径中，ER自噬参与了细胞凋亡过程，这可能为药物开发提供新的靶点。
图6. 用25 μM 顺铂孵育的 3T3 细胞中内质网和自体的FLIM 成像。（A）在25 μM 顺铂孵育 24 小时下用 5 μM CF2 染色的 3T3 细胞的 FLIM成像。（B）变焦ROI 1 和 ROI 2 的荧光寿命衰减（C）平均荧光寿命 τi作为顺铂刺激下 24 小时的 ER-phagy 的函数。（D）两个双指数拟合分量的比例 τ1和τ2。
这项工作促进了细胞水平上细胞器相互作用调节机制的研究，而探针CF2在器官水平甚至体内复杂生命活动中的未来应用需要进一步研究。作者预计，本文描述的荧光寿命探针以及未来基于时间分辨策略开发的广泛探针将作为时间分辨工具得到重要应用，以努力实现对细胞器相互作用的全面理解，并将为神经生长和退行性疾病的治疗提供启示。
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