北京理工大学于洋课题组通过利用工程化细胞色素P450突变体P411-PFA，实现了单萜化合物非天然三氟甲基化环丙烷衍生物的合成，并将这种非天然环丙烷化反应与重组的L-香芹醇合成酶在大肠杆菌中整合，实现了从前体物到三氟甲基化L-香芹醇衍生物的一锅法生物合成。

细胞色素P450酶是一种具有广泛生物催化作用的蛋白质，能够促进各种非天然反应。通过将非天然转化与微生物生物合成途径相结合，可以实现天然产物衍生物的可持续酶促生产。在药物研究中，三氟甲基化修饰由于其对药物活性、生物利用度和代谢稳定性的正向影响，被视为一种可取的修饰方式。工程酶生物催化是安装三氟甲基到天然化合物支架上的有效策略。含血红素的酶，如肌红蛋白和细胞色素P450突变体P411-PFA，已被证明可以催化三氟甲基卡宾从三氟甲基重氮甲烷（CF₃CHN₂）转移到含烯烃的底物，但与卡宾转移酶兼容的底物范围仍然有限。

为了扩大底物范围，本研究利用工程细胞色素P450变体P411-PFA从12种天然单萜化合物中筛选出可以与重氮乙酸乙酯发生卡宾转移反应的6种底物，随后将重氮供体替换为三氟甲基重氮供体CF₃CHN₂，这6种底物被进一步筛选是否具有三氟甲基环丙化反应活性。最终，P411-PFA成功催化三氟甲基卡宾从CF₃CHN₂转移到L-香芹醇、香芹酮、紫苏醇和紫苏葶等4种单萜的末端烯烃上，生成相应的三氟甲基化环丙烷产物。（图1）。

此外，生物催化卡宾转移的一个关键优势是可以将这些非天然反应整合到天然的生物合成途径中，以进行体内合成。通过共表达酶CYP71D18和ATR2，论文研究者在大肠杆菌中实现了由柠檬烯前体合成L-香芹醇。通过将L-香芹醇生产与P411-PFA催化的三氟甲基环丙烷化结合，所得到的菌株使三氟甲基化L-香芹醇衍生物能够一锅法生物合成（图2）。

本研究证实了将合成酶化学与天然生物合成途径相结合，可构建可持续生产有价值氟化萜类化合物的平台。随着柠檬烯等单萜的生物合成途径在宿主中继续被设计，本文提出的方法可以为进一步扩展从廉价原料中生产有价值的三氟甲基化萜类衍生物提供基础。此外，结合不同重氮卡宾前体的微生物合成路线的设计，最终可能实现广泛的非天然环丙烷化化合物的完全生物制造。