在JACS上报道的一篇标题为 “Fluorescent Biosensor for Measuring Ras Activity in Living Cells” 的文章。该文的通讯作者是加州大学圣地亚哥分校化学与生物工程系的张锦教授。在本文中，作者团队开发了一种可用于活细胞中的Ras 活动报告器 (RasAR)，它提供了在活细胞中高时空分辨率的Ras行为活动的定量测量，并发现RasAR能够探测Ras的所有主要亚型的活细胞活性。 Ras蛋白是一种小的GTP酶，是细胞生命活动的关键调控因子，作为生长因子受体下游的分子开关来调节细胞的生长和增殖。它的活性在一些癌症中经常发生失调，这促使了数十年来针对Ras的药物研究。因此，对细胞活动中Ras蛋白活性的检测和调控是非常重要的。传统研究依赖于Ras的富集鉴定和Western Blot印迹分析，但这类方法难以实现活细胞中具有时空特异性的Ras活性变化研究，且检测通量难以提升；通过基因编码引入荧光蛋白实现跟踪胞质Ras活性变化或利用Ras相互作用蛋白的FRET效应虽然能够得到时空特异性的结果，但由于对Ras进行了基因层面的改造而往往难以反映真实情况。因此，需要开发新的高分辨率的活细胞Ras活性调控传感器。 在本文中，作者团队开发了一种可直接对Ras蛋白活性进行研究的传感器。他们利用了Ras配体之一Raf1 的RBD作为传感元件，其在有配体和无配体结合时分别处于不同构象。利用一个短肽QNHFVDEYDPTI 作为假配体与之结合，控制它的亲和力小于Ras活性蛋白。将这个构建夹在一对FRET蛋白对之间，在没有Ras的情况下，假配体与RBD结合，使荧光蛋白接近以促进FRET。活性Ras与RBD的结合取代了假配体，导致FRET的减少。他们在COS-7细胞中利用该传感器检测了野生型KRas，KRasG12C，KRasS17N等多个突变体的活性，发现KRasG12C，KRasS17N等活性突变相比于野生型KRas，其FRET信号发射比率更高。对其他几种Ras亚型如HRas，NRas等的活性研究也得到了同样的结果，证明了FRET现象中的C/Y发射信号比率可以反映Ras蛋白的活性情况。(图1)。图1. RasAR的设计思路，及其能够实现Ras所有主要亚型的定量活细胞活性测量 随后，该团队在COS-7细胞、Hela细胞、HEK-293T细胞等多种细胞类型中转染了RasAR传感器以分析该传感器能否时空动态地观测Ras活性变化。在这几种细胞系中，对几种Ras亚型敏感的RasAR传感器都在EGF生长因子刺激后展现了显著的FRET信号增加，并在加入EGF抑制剂后显著下降，这个过程可以在10-20分钟内完成。FRET信号主要集中在膜褶以及高尔基体腔，这也是Ras蛋白主要表达和富集的区域。这些数据共同证明了RasAR可以时空动态地对Ras活性进行研究。(图2)。图2. RasAR能够监测活细胞中受EGF刺激后，Ras活性的时空特异性变化 该团队接着研究了Ras相关功能蛋白对其活性的调控。Src是细胞经由膜外EGF刺激后的重要元件之一，也是Ras上游的信号蛋白，早期有研究指出Src的激活能抑制HRas的活性变化和高尔基体定位。因此，作者团队用构建出的RasAR针对这一事件进行了研究。他们分别在序列N端和C端引入质膜定位序列和高尔基体定位序列，命名为pm-RasAR和GA-RasAR，使其锚定在膜内侧和高尔基体中。当细胞被用EGF处理后添加去磷酸化酶PP2，也即抑制Src信号分子的活性，从荧光信号的变化中可以看出，高尔基体中的HRas在PP2处理后活性明显上升，而质膜处的HRas活性则没有明显变化。前人有研究表明，HRas受Src磷酸化调控的位点主要是32和64位的Y，因此作者团队将HRasY32/64F和RasAR共同表达，经这样处理的荧光信号即不随Src被抑制而增强，表明了HRas活性的保持。(图3)。图3. 利用RasAR检测HRas的活性受Src调控 最后，该文章进行了活细胞环境中的Ras活性抑制监测。由于Ras是一类非常重要的癌症治疗靶点，而传统的Ras抑制水平分析则需要进行Western Blot，相对繁琐且不能体现动态性。因此，作者用RasAR对经由ARS1620（一种kRAS G12C共价抑制剂）处理的COS-7细胞进行了Ras水平变化分析。从荧光比率结果可以看出，kRas活性随着ARS1620浓度升高和处理时间增长均有下降，这与其抑制Ras活性的功能是一致的。(图4)。图4. RasAR能够监测活细胞中Ras的外源性抑制 综上所述，该文章报道了一种新的生物传感器RasAR，具有基于假配体的设计，以报告活细胞中Ras活性的动态变化。与传统的生化分析方法相比，RasAR能够在活细胞中跟踪Ras的活性变化。与目前已有的Ras生物传感器相比，RasAR的主要优势是该生物传感器本身不包含Ras，因此能够针对不同Ras亚型的蛋白进行分析，且基本不影响细胞中本身的Ras表达水平，是一种新颖的Ras活性检测传感器，有望进一步应用于分子生物学研究中。DOI: 10.1021/jacs.2c05203Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c05203
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