分享一篇近期发表在Biomaterials Science上的研究进展，题为DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption。文章的通讯作者是来自德国马普所的Smriti Singh教授。

    中性粒细胞是一种白细胞，中性粒细胞胞外杀菌网络(Neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞在炎症条件下产生和释放的网状结构，NETs 由核酸物质组成，不含任何细胞骨架蛋白。在执行杀菌功能的同时，NETs也会促进凝血级联系统的激活和血栓的形成。当血液与人工肺ECMO或者血管内移植物的人工表面接触时，NETs的形成尤其显著，这带来了潜在的血栓风险。核酸内切酶DNase I可以消化NETs的主干DNA结构，作者通过将DNase I共价连接在高亲水性的微凝胶上，在保持酶活性的同时，提高了DNase I在血清中的稳定性，制备了一种新型的功能化偶联物。

图1. 微凝胶制备流程示意图

    作者使用甲叉双丙烯酰胺(MBAA)作为交联剂，通过反相微乳液聚合，制备了N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和羧酸甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)摩尔比17:3的共聚微凝胶，制备流程如图1所示。酶与底物的相互作用程度是影响酶活性的关键因素，因此，在酶-微凝胶偶联物中，交联密度和凝胶孔隙大小影响底物的扩散速率和酶的反应效率，和对于酶活性的保持至关重要，作者通过调节交联剂的比例控制了微凝胶的粒径、孔隙大小和机械性能，间接地控制了酶活。

图2. DNase I微凝胶偶联物的制备与表征

    作者选用牛胰腺DNAase I作为模型核酸酶，使DNAase I上的赖氨酸残基与微凝胶羧酸甜菜碱上的羧基反应形成酰胺键，从而形成偶联物(图2)。在偶联中使用pH=7.4的PBS缓冲液条件，此时DNAase I带负电荷，而微凝胶由于与sulfo-NHS反应生成酯带正电荷，促进了偶联反应的发生，反应后偶联物整体呈电中性。如图2所示，添加3%交联剂的微凝胶偶联物平均粒径为77.3±1.4 μm，呈球形，且圆二色光谱显示DNAase I的二级结构变化不大。

图3. 偶联物XPS分析结果

    高分辨率的XPS实验进一步确认了DNAase I偶联前后微凝胶的组成(图3)，偶联后微凝胶的酰胺键与酯键相关峰的强度明显提高，且碳氮比明显下降，这均是偶联反应发生的有力证明。此外，实验表明该偶联物还具有出色的抗污能力，能有效地防止蛋白质的吸附污染。

    作者使用不同浓度的荧光标记DNA探针作为底物来测量偶联物中DNAase I的酶活性。这种DNA探针在被内切酶切割后会释放荧光，通过检测特定波长下的荧光强度的方法，作者获取了DNAase I的酶活性(图4)。计算表明，与游离酶相比，DNAase I偶联物中酶与底物的亲和力高得多，偶联增强了酶与底物的相互作用，这可能是酶的局部密度升高和质量运输效应增强的结果。

图4. 偶联物酶活测定机理及结果

    作者还测试了DNase I偶联物在生物培养基中消化NETs的效率，将偶联物与连续分泌NETs的受刺激多形核中性粒细胞一同孵育，并使用延时显微镜观察(图5)。接受刺激的中性粒细胞在孵育1.5 h后开始形成NETs(橙色)，与对照组相比，偶联物的添加显著抑制了培养基中NETs的形成，并可以有效清除已形成的NETs。

图5. DNase I 偶联物在生物培养基中消化NETs的效率

    综上所述，作者成功地设计并制备了一种新型的可破坏NETs的DNase I-微凝胶偶联物，这种微凝胶同时具有抗污能力，未来可以作为人工医疗器械中的涂层材料，以降低NET介导的炎症和微血栓形成的风险。

作者：SYM  审校：DYH

DOI: 10.1039/d1bm01591e

Link: https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2022/bm/d1bm01591e