发表在JACS上的文章，题为π‐Clamp-Mediated Homo- and Heterodimerization of Single- Domain Antibodies via Site-Specific Homobifunctional Conjugation。文章的通讯作者是来自剑桥大学的Michele Vendruscolo教授及Gonca̧lo J. L. Bernardes教授。

    蛋白质-蛋白质偶联物在推进生物技术和生物制药领域的发展中具有重要作用，例如双特异性抗体、双功能酶等。尽管融合表达是常用的方式，但这一方法的局限性在于结构域的不正确折叠，仅能N-C融合等等。翻译后蛋白质-蛋白质偶联策略能够拓展多样性，例如N-N，C-C偶联等。通常的方法则是通过带有功能性反应基团的连接子与蛋白反应。

    例如马来酰亚胺与半胱氨酸巯基的反应极为常用，但可能发生逆迈克尔加成以及与内源硫醇的交换反应。如图1所示，本文中，作者使用双五氟苯磺酰胺官能化的连接子（L1/L2）制备得到了更加稳定连接的蛋白质-蛋白质偶联物。事实上，有两种针对SARS-CoV-2刺突蛋白蛋白受体结合域（RBD）上两个不同表位的计算设计抗体C1及C2。将其偶联制备同/异二聚体有利于增加其大小，提高结合亲和力。因此作者以此为模型进行实验。

图1. 五氟苯磺酰胺连接子与抗体C1/C2

    首先，作者将C1进行工程化，在序列中引入半胱氨酸。C1-DCE中含有D-C-E，C1-π中含有π夹序列（F-C-P-F）。实验发现，C1-DCE的反应性不足以转化为完全修饰的单体，但C1-π反应性明显更高，在温和条件下3小时内完全转化为C1-L1，如图2所示。除此之外，制备的C1-π突变体C1-A-C-P-A对照的实验结果也表明，π夹序列是增加反应性的来源，对于二聚化制备必不可少。

    因此作者在连接子L1与C1-π孵育24小时后，制备得到了同二聚体C1C1-L1。类似的，也通过连接子L2及C2-π制备了不同的同二聚体。异二聚体的制备则是通过将纯化后的C1-L1与C2-π孵育。纯化后的偶联物经过SDS-PAGE的表征及二级结构，热变性温度的测试，表明其结构未受到影响，且具有稳定性。

图2. 同二聚体/异二聚体制备及生物物理性质表征

    接下来，作者探究了异二聚体制备的第二步反应是否对π序列的半胱氨酸具有选择性。由此，作者设计了C1-π-DCE，在Tev酶切割序列的上游与下游分别含有D-C-E序列与π夹序列（F-C-P-F），即两个不同的半胱氨酸，如图3所示。作者制备了C1-π/C1-π-DCE-L2异二聚体，并使用Alexa-647荧光染料与仍暴露的半胱氨酸反应，随后使用Tev酶切。实验结果如图3bc。Tev酶切割后二聚体未解偶联，并且荧光分子并未与C1-π-DCE一同被切下，说明反应按照图3a所示发生，偶联步骤对π序列的半胱氨酸具有特异型。

图3. C1-π/C1-π-DCE-L2异二聚体制备及表征

    最后，作者评估了二聚体对抗体K_D的影响。微尺度热泳测量的结果表明，二聚体相对于组成的单体K_D值提高10-60倍。这是由于“强制邻近效应”导致偶联物解离变慢。不同的二聚体均具有相似的K_D值，说明他们与RBD的结合模式相似。

图4. K_D值测定

    总体而言，本文中使用五氟苯磺酰胺连接试剂与基于π夹序列的半胱氨酸制备得到了化学位点特异性的蛋白的同二聚体及异二聚体。这种温和的方法有希望应用于制备更多的双特异性ADC等有希望的治疗药物。

作者：ZRC    审校：LCY

DOI: 10.1021/jacs.2c04747

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.2c04747