推荐一篇发表在ACS Central Science上的文章，题目为“Photoproximity labeling from single catalyst sites allows calibration and increased resolution for carbene labeling of protein partners in vitro and on cells”，通讯作者是来自美国加利福尼亚大学旧金山分校的美国科学院院士James A. Wells，他在蛋白质工程、小分子药物发现和细胞表面蛋白质组学等领域做出了重要贡献。

 细胞表面蛋白组学在几乎所有胞外生物学过程中都发挥着至关重要的作用，然而，膜蛋白受到生物膜的限制，其构象变化的自由度较低，相互作用更弱，很难被传统的下拉实验鉴定到。基于此，临近标记技术应运而生，通过在原位生成含有生物素的反应性物质的方法，实现对临近蛋白组的捕获和富集，但目前的临近标记技术还有一定的局限性，如过长的标记距离或只能对特定氨基酸残基进行标记，难以用于复杂细胞环境，尤其是细胞表面蛋白组瞬时相互作用的分析。 

2020年，Oslund、Fadeyi和MacMillan在Science上报道了一种更高分辨率的邻近标记蛋白质组学方法μMap。μMap能通过生物素化的双吖丙啶（diazirine）局部生成短寿命的卡宾，不加选择地标记多种类型的氨基酸。然而，μMap方法需要在与感兴趣蛋白的一抗结合的二抗上引入6-8个铱催化剂，且引入的位置是随机的，导致标记距离难以精确测量。因此，在这篇文章中，作者将铱催化剂特异性地引入到一抗的单一位点上，从而校准了从光催化剂位点到靶标的标记距离。

作者利用甲硫氨酸和氮氧杂环丙烷的特异反应，实现了抗体单一位点的特异性标记，并用曲妥珠单抗（Traz）与HER2的相互作用为模型进行验证。作者首先在抗体Fab的八个不同位点引入铱催化剂，在体外进行了分子内自标记的研究，作者发现每个距离上探针标记机会与残基和铱催化剂之间的距离相符，表明探针的标记是均匀的，并且，探针对标记的氨基酸类型没有偏好，可以广泛地标记多种氨基酸。

接下来，作者通过分析质谱数据确定了八种引入铱催化剂的抗体Fab与HER2结合形成的分子间标记的特征。作者发现与HER2结合时，抗体Fab的自标记程度较低。每个抗体Fab在HER2上标记位点有所重叠，但都有独特的标记模式。作者确定了抗体Fab在HER2上的标记范围为20 Å~110 Å，并提出抗体Fab在HER2上可能的最远标记距离约为120 Å。

最后，作者利用不同的Fab-催化剂复合物结合SKBR3细胞上的HER2，确定了细胞表面的HER2相互作用组。八种催化剂总共捕获了742个蛋白质，其中约90%被注释为膜蛋白。作者还将铱催化剂共轭到膜锚定的脂肪酸上，构建了一个非特异性标记的FA-催化剂复合物作为背景对照，以此鉴定了被抗体Fab特异性富集的蛋白，并表明特异位点的催化剂连接能提供比在二抗多位点连接催化剂的μMap技术更高的分辨率和可信度。

总之，作者通过在蛋白一抗的单一位点特异性引入铱催化剂，校准了光临近标记的标记距离，并提高了光临近标记细胞表面蛋白组相互作用的分辨率和可信度。

本文作者：ZCL

责任编辑：FTY

文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.3c01473