发表在Nature Methods上的文章，本文的通讯作者是来自北京大学生命科学学院的李毓龙教授，他们课题组的主要研究方向是开发前沿的成像探针研究在时间和空间尺度上研究神经系统的调控复杂机制。第二位通讯作者是来自北京脑科学与类脑研究中心的Miao Jing教授，他们课题组主要研究调节生理功能的信号分子的检测技术。在本篇文章中，作者优化了他们之前开发的，在生理条件下检测乙酰胆碱的“感应器”GRABACh（GPCR-activation-based ACh），使其对乙酰胆碱的检测灵敏度大大升高，并减少了其与下游通路造成的耦合。

      神经递质乙酰胆碱是神经信号传递的重要物质，广泛参与多种生理过程。直接检测生理状态下的乙酰胆碱可以更好地了解其在生物体中的作用。在之前的研究中，胆碱能的测定主要是通过检测电生理的记录尼古丁受体介导的电流以及通过像CNiFERs这样的细胞传感器，将细胞外的乙酰胆碱动力转化为细胞内的钙离子信号来检测。这些方法无法针对细胞类型对乙酰胆碱的信号进行测量，也无法实现乙酰胆碱检测所需要实现的时空分辨率。所以作者在之前的研究中，设计了一种通过乙酰胆碱诱导，利用GRAB对乙酰胆碱的感受，最后使得乙酰胆碱受体偶联的重组GFP荧光信号发生改变的生物传感器。其中乙酰胆碱受体为3型毒蕈碱乙酰胆碱受体（M3R），该受体连接一个环状重组GFP蛋白，当M3R接收到信号后，会通过改变信号从而导致GFP蛋白的发光。这种他们之前用于检测乙酰胆碱的生物传感器被称作GACh2.0，简称Ach2.0。本篇文章改进了该传感器的灵敏度和特异性。

       首先，作者利用随机突变，在Ach2.0的基础上，对M3R和cpGFP界面的氨基酸，和受体细胞内第三loop（ICL3）和连接的肽段进行了随机突变。检测突变后信号反应性和荧光信号强度两个指标。从而选了信号最强的一个传感器GRABACh3.0，简称ACh3.0。同时他们也把一个W200A的一个对信号不敏感的突变体作为阴性对照。他们在实验中发现，ACh3.0在细胞中可以很好地定位到神经元的脂膜上，并转移到神经元的树突和轴突。并且在使用100μM的乙酰胆碱处理细胞时，ACh3.0比Ach2.0具有更强的荧光信号。通过检测作者发现ACh3.0具有跟内源的M3R类似的动力学常数，和与Ach2.0类似的EC50值。不仅如此，实验还证实了Ach3.0几乎对主流的G蛋白偶联受体介导的下游通路没有什么影响，对神经元的生理特性也没有影响。由此作者通过对传感器的优化，得到了灵敏度和特异性都很优异的Ach3.0乙酰胆碱检测传感器。

      随后作者在果蝇中检测了Ach3.0的效果，并且检测了转基因果蝇在对外界的气味和身体震动刺激时，其嗅觉中心中乙酰胆碱的分布。实验的最后利用纤维分光光度法和双光子成像的方法，利用Ach3.0还灵敏的检测出在执行各种行为时，小鼠多个大脑区域的乙酰胆碱单次动态实验数据。

      总的来说，作者通过优化检测乙酰胆碱的传感器Ach2.0，得到了可以在时间分辨率的水平上检测乙酰胆碱的有效的生物传感器。

文章作者：WYK

责任编辑：LZH

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0953-2

原文引用：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0953-2