分享一篇JACS上的文章，本文的通讯作者来自荷兰莱顿大学医学中心Oncode研究所和细胞与化学生物学系的Peter ten Dijke教授和Paul P. Geurink教授。

      泛素是一种小蛋白，由76个氨基酸组成，可通过赖氨酸残基修饰靶蛋白。在细胞中ATP依赖性偶联反应中，通过E1，E2和E3酶的特定组合的系统来催化泛素的添加。在人类中，约有100种去泛素化酶（DUB）能够去除泛素化修饰。泛素羧基末端水解酶L1酶（UCHL1）是一种从小的底物中去除泛素的小蛋白酶。UCHL1可以裂解泛素，并且该酶的突变和活性降低与帕金森氏病和阿尔茨海默氏病等神经退行性疾病有关，然而这些过程的分子机制还不是很清楚。一个具有细胞渗透性的具有UCHL1活性的探针，对于了解其在胚胎发生和成人组织中的正常功能将是很重要的工具。然而，DUB通过蛋白之间的相互作用与泛素结合，这被认为很难通过干扰使用小分子进行干扰。但是最近发展了一些能够特异性地抑制特定的DUB的小分子抑制剂，这也催生了作者发展UCHL1特异性探针的想法。

      作者通过之前的报道，发现了（S）-1-氰基吡咯烷-3-羧酰胺基化合物可以通过抑制UCHL1的活性半胱氨酸位点，并且以亚微摩尔的能力抑制UCHL1活性。这些化合物配备有氰酰亚胺部分，该反应基团会与硫醇反应形成异硫脲共价加合物，并且被认为可逆反应。于是作者决定以该化合物作为潜在的探针的研究起点。

      首先，作者发现了该种类化合物中存在一个化合物6RK73能够在体外和细胞中有效地抑制UCHL1的活性，并且能够很好地区分对于其他DUB的活性。基于6RK73的结构，作者在该分子上连接上了许多报告基团，例如荧光基团、富集基团，正交基团等，设计出了不同种类的ABP探针。同时作者也系统地在体外和体内比较了不同的标记效率，穿膜效率，抑制效率等。以荧光报告基团为例子，作者基于6RK73的结构，设计了带有不同荧光显色团的ABP探针8RK59, 9RK15和9RK87。在体外的实验中，作者发现这些不同的ABP探针都可以抑制UCHL1活性，并且能有效地区分其他DUB，选择性结合UCHL1。同时，作者还评估探针穿透细胞膜，标记细胞中活性UCHL1的能力。作者发现，由于Bodipy荧光团的穿膜效率远远高于罗丹明荧光团。因此，作者决定继续使用8RK59（Bodipy-ABP）作为所后续实验的首选探针。

     在体内标记的中，作者发现除了对应于ABP标记的UCHL1的条带外，凝胶上还出现了一些其他条带。为了更好地将8RK59更好地将其应用于后续UCHL1成像，作者用质谱的方法鉴定该探针的潜在的脱靶蛋白。质谱结果显示，除了最明显富集的UCHL1外，也富集了另一个分子量为20 kDa的蛋白质脱糖酶PARK7（DJ-1）。同时，作者也用两个biotin探针11RK72和11RK73进行质谱鉴定，使用Maxquant软件计算基于强度的绝对定量（iBAQ）值，发现PARK7和UCHL1的iBAQ值是最高的，也就是说，除了UCHL1之外，该探针最大的脱靶蛋白是PARK7。

      接着，作者用8RK59探针在A549细胞系进行成像，作者通过shRNA介导的慢病毒转染来敲低UCHL1或PARK7，以评估PARK7的干扰。实验结果表明，8RK59可以穿透并标记活细胞，与对照组和shPARK7组相比，shUCHL1组的8RK59信号显着降低，也就是说在细胞成像方面，基本上可以排除PARK7的干扰。

     为了研究8RK59在体内动物模型中追踪UCHL1活性的应用和特异性，作者在斑马鱼模型中进行了动物模型实验。作者通过分别在胚胎单细胞阶段注射靶向UCHL1的两个独立的MO分子，生成了UCHL1敲除的斑马鱼胚胎。注射后两天，靶向UCHL1的两个独立的MO表现出相似的卷曲尾巴表型，对照注射组未显示明显的卷曲尾巴斑马鱼胚胎。在验证斑马鱼胚胎中的UCHL1被敲降后，作者分别对有/无注射UCHL1-Mo的胚胎进行荧光图像，结果显示，与未注射和对照组相比，两个UCHL1-MO注射组中的8RK59信号显着降低。而对于前文说到的脱靶蛋白PARK7，根据胚胎的荧光成像的结果分析，在PARK7基因敲除的斑马鱼胚胎中未检测到8RK59信号的显着降低。

     总之，本文发展了第一个荧光小分子DUB-ABP探针，该探针可以在体外，细胞内和活体内对于UCHL1进行成像，同时抑制UCHL1的活性。该探针对于解决泛素化领域的问题提供了一个有用的工具。这将有助于开发针对泛素化相关疾病的未来疗法。

本文作者：LSC

责任编辑：LZH

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.0c07726

原文引用：https://dx.doi.org/10.1021/jacs.0c07726