发表在JACS上的论文，通讯作者是来自香港大学化学系的杨丹教授，她的研究方向涉及有机化学和化学生物学，专注于研发小分子探针用于生物体系内化学物质的检测和细胞成像、开发新型活性药物分子以及探究生物系统中信号转导过程和药物靶向蛋白。这项研究中作者合成了一种重氮香豆素化合物，可以被可见光(430-490 nm)和近红外光(800 nm)光激活，使产生的活性卡宾中间体发生插入反应，从而快速、选择性地荧光标记活细胞内的内源性蛋白。
在活细胞中选择性标记蛋白质对于确定蛋白质的功能、定位和动力学是至关重要的。精确蛋白质标记可以通过重组蛋白表达技术实现，如荧光标签蛋白与目标蛋白的融合表达。然而，这些方法只能应用于能够进行基因操作的细胞类型，同时大的融合蛋白可能扰乱感兴趣蛋白的功能。然而小分子化学修饰蛋白质能够最大限度地减少了对蛋白质功能的干扰，并绕过了遗传操作的需要。卡宾介导的插入反应由于能够广泛修饰氨基酸残基被证明是蛋白质标记的通用方法。该反应不仅可以在金属催化剂的催化下进行，也可以以光化学方式进行。光化学反应中，卡宾活性中间体需要紫外线照射激活产生，但由于损伤DNA或产生的活性氧对生物分子和细胞有害而阻碍了在活细胞中的应用。作者提出了一种新的光化学方法，通过将卡宾前体重氮基团连接到香豆素的π共轭体系，使得重氮基团的激发波长从紫外光区域大幅红移到可见光区域，因此采用长波照射避免紫外光照射的细胞毒性；并且不需要点击化学，以生物相容性的方式标记特定的细胞内蛋白质。他们首先合成了化合物1，发现当R为H时，经蓝光照射后生成的卡宾中间体大部分经过Wolff重排形成非荧光扩环产物；当R为CF3时可以阻止卡宾中间体的分子内重排，因此设计合成了化合物2，结果显示大多数产物是发射荧光的。进一步经过稳定性考察，化合物2处于黑暗条件下，在广泛的pH范围内或谷胱甘肽存在下均保持良好的稳定性。
由于重氮香豆素探针独特的荧光性质和标记条件的生物相容性，可以进行细胞内的活细胞成像，以碳酸酐酶-II(CA-II)作为选择性标记的目标蛋白，鉴于该蛋白可被4-羧基苯磺酰胺(CBS)可逆抑制，作者通过简单的酰胺接头将化合物2与CBS进行连接，合成了CA-II的荧光探针。经过SDS-PAGE测定，该探针可以有效标记MCF7 活细胞中的CA-II；从HCT116细胞激光共聚焦的标记结果来看，HCT116细胞的胞浆区均观察到较强的荧光，当加入CBS与探针竞争时，荧光信号被减弱，与文献报道的CA-II胞浆分布一致。
CA-IX在癌症治疗中是一个潜在靶点，在缺氧肿瘤细胞中明显过表达，且受缺氧诱导因子1(HIF-1)的调节；DFO可以通过抑制PHD2稳定HIF-1从而模拟缺氧条件，以诱导CA-IX表达上调。用探针3标记DFO处理的细胞，成像结果显示细胞膜上积累了大量信号，信号可以通过CBS处理而消失。结果表明，该探针可以用来标记在特定条件下动态表达的蛋白。
此外，作者还测试了是否可以利用近红外光(NIR)双光子激发探针形成卡宾中间体。首先用化合物3处理MCF7细胞，结果在暴露于近红外光（800 nm）的细胞中检测到更强的荧光信号，这表明在活细胞中可以实现CA-II的双光子激活标记。该探针的双光子激活的能力将对细胞的光毒性减至最小，且穿透能力更深。
总之，该研究合成的重氮香豆素探针具有高效可见光活化和荧光特性，可以作为内源蛋白标记的正交工具。
本文作者：ZJ
责任编辑：LYP
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c08068
原文引用：DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.0c08068
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