分享一篇发表在JACS上的文章，本文的通讯作者是普林斯顿大学化学系的Ralph E. Kleiner教授，他们课题组主要基于合成和化学酶策略进行RNA修饰、化学蛋白质组学和定量细胞成像的研究。

      利用修饰的核苷酸进行细胞RNA掺入是标记RNA的有效方法，核苷酸作为生物正交标签、光亲和标签等被广泛的应用于活细胞中转录动力学和蛋白质-RNA相互作用的研究。目前最常用的策略是通过细胞摄取和激活的修饰核糖核苷，但是该方法获得的修饰核苷酸范围有限，并且目前仍缺少低毒性的并且可以应用于体内的细胞特异性或RNA聚合酶特异性的标记。本文中作者研究了一种与生物正交SPAAC相容的修饰核苷2'-叠氮基胞苷（2'-AzCyd），能够实现细胞和聚合酶选择性代谢标记。

      2'-叠氮基RNA核苷是一类潜在的生物正交RNA标记物，其中2'-叠氮基腺苷（2'-AzAd）主要通过polyA聚合酶整合到mRNA中，而2'-叠氮基嘧啶核苷在RNA标记中的应用仍有待研究。本文作者为了进一步研究代谢性2'-叠氮核苷标记，用2'-AzAd或嘧啶核苷（2'-叠氮尿苷（2'-AzUrd）和2'-AzCyd）培养HeLa细胞，并通过CuAAC和荧光显微镜评估RNA插入情况，发现2'- AzAd和2'- AzCyd都有不同程度的摄取，但是与2'-AzAd相比，2'- AzCyd标记强度不高。2'-AzCyd的标记pattern中，细胞核和胞质的核仁中都有很强的染色，与RNA掺入一致。为了确认是RNA标记，他们研究了放线菌素D（一种RNA聚合酶抑制剂）或羟基脲（一种DNA合成抑制剂）对标记的影响，发现2'-AzCyd标记不受羟基脲的影响，但是放线菌素D显著降低标记信号。接下来，作者利用HPLC研究了嘧啶核糖核苷和脱氧核糖核苷激酶（UCK2和dCK）分别对2'-AzCyd 和2'-AzUrd磷酸化的影响，发现dCK在2'-AzCyd上表现出更高的活性。并且2'-AzCyd被dCK磷酸化的速度比它的天然底物脱氧胞苷更快。

      作者推测dCK的过表达可以增加掺入并为细胞特异性标记提供途径，因此在Hela细胞中分别转染了dCK 和UCK2质粒，发现二者的过表达都可以提高2'-AzCyd的标记，其中dCK更为显著，而二者对2'-AzUrd的标记影响不大。之后，他们使用定量核苷LC-MS / MS测量了总RNA中的修饰水平，验证了dCK过表达能够显著增加2'-AzCyd的掺入。之后，作者使用包含稳定的可诱导dCK的HeLa细胞系进一步表征了细胞RNA中的2'-AzCyd标记，发现2'-AzCyd的毒性远小于目前常用的核糖核苷类似物4-SU，并且2'-AzCyd主要积累在28S和18S的大型rRNA以及由5S RNA，tRNA和其他小型非编码RNA组成的小RNA中，这与2'-AzAd等主要标记mRNA的标签不同。最后，作者在dCK过表达细胞系中用2'-AzCyd进行了脉冲追踪实验，验证了2'-AzCyd主要以依赖于RNA Pol I的方式整合到核糖体RNA中。

      总之，本文介绍了一种2'-AzCyd-dCK pair作为细胞和聚合酶特异性RNA标记的策略，具有更低的毒性和RNA聚合酶选择性。

本文作者：Cheny

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c04566

原文引用：DOI: 10.1021/jacs.0c04566