发表在nature chemistry上的一篇关于鉴定Fic酶腺苷酸化修饰的靶标的文章，通讯作者是来自瑞典于默奥大学的Christian Hedberg教授以及德国慕尼黑工业大学与德国汉堡大学附属埃彭多夫医院的Aymelt Itzen教授。
许多病原菌使用酶介导的PTM来确保其在感染过程中的存活，增殖和毒力，其中AMPylation（也称为腺苷酰化）是一种被许多细菌使用的用来修饰宿主细胞蛋白的PTM。单磷酸腺苷（AMP）转移酶催化AMP部分从共底物三磷酸腺苷（ATP）连接到苏氨酸，酪氨酸或丝氨酸侧链。从一种丝状大肠杆菌的表型中发现了一类蛋白质，称为环状AMP诱导的丝化（filamentation induced by cyclic-AMP，Fic），后来被发现与AMPylation反应有关。从细菌病原体副溶血性弧菌和嗜酒性嗜血杆菌中，研究发现Fic酶在感染过程中会引起宿主细胞的AMPylation。生物信息学研究揭示了一段保守的氨基酸序列HxFx（D/E）GNGR，这一motif存在于所有生命形式中（称为Fic基序），包括人Fic蛋白HYPE / FicD。即使可以通过其保守的Fic基序的存在来明确鉴定Fic酶，但无法以系统的方式预测其靶标。只有少数靶蛋白被偶然的鉴定出来，而Fic酶对宿主细胞的多种作用无法通过已知的少数几个靶标来充分解释。当前已有使用抗AMP抗体，使用ATP类似物的点击化学手段以及荧光或同位素标记的ATP类似物来进行靶标识别。但是抗AMP抗体对某些表位表现出强烈的偏好，而基于核苷酸类似物的方法会受到细胞或裂解液中高水平内源性ATP的竞争。在过去的十年中，基于活性的蛋白质profiling（ABPP）改变了快速识别靶标的方法，具有特定酶活性的小分子抑制剂在体外和体内都已经发挥了作用。在本篇文章中，作者开发了一种方法将酶本身视为大分子ABPP样探针，核苷酸共底物在酶的核苷酸结合位点内共价连接并活化，之后用来捕获底物。他们将这一概念称为共底物介导的共价捕获。
该策略基于Fic酶活性中心中策略性放置的半胱氨酸与合成的巯基反应性核苷酸衍生物（TReND；例如，氯乙酰胺，溴代烷基）的高度特异性和稳定的共价反应。然后，通过在Fic TReND和靶蛋白之间产生稳定的共价复合物，将这些共价的FicTReND复合物随后用作捕获和鉴定其细胞靶蛋白的二元探针。他们的方法避免了与内源核苷酸的竞争，因为工程化的Fic酶的活性位点已经被核苷酸衍生物不可逆地占据。
作者应用这种方法来鉴定致病性Fic酶免疫球蛋白结合蛋白A（IbpA）和Bartonella效应蛋白A（BepA）以及人类HYPE / FicD的靶蛋白。除了已知的生理底物，他们还确定了IbpA，BepA和HYPE的新靶标。此外，他们解了IbpA的Fic2结构域和Cdc42的共价连接复合物的晶体结构，使用TReND作为双功能的共价linker，验证了共底物（核苷酸衍生物）的完整性以及靶标结合在接近天然的条件下。
本文作者：CY
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-020-0484-6
原文引用：DOI：10.1038/s41557-020-0484-6
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