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分享一篇2023年发表在Journal of the American Chemical Society上的文章,μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping1。该文章的通讯作者是来自美国普林斯顿大学化学系的David W. C. MacMillan教授。
目前,药物发现主要分为两种方式:基于靶点的药物研发(Target-based
drug discovery,TDD)和基于表型的药物筛选(Phenotypic
drug discovery, PDD)。表型筛选主要是在细胞或动物水平开展实验,因此蛋白靶点以及蛋白-配体结合模式一开始就是未知的,如何在确定活性分子后快速地找到其作用通路、靶点、结合位点、结合模式(正构/别构)一直以来都是众多研究员所关心的问题。常规的蛋白质组学差异性分析能够帮助我们快速确认作用通路、发现潜在靶点,但却缺少更精细的结构信息。光亲和标记(Photoaffinity
Labeling)能够有效地补充这方面的信息,将PAL探针靶向交联至靶蛋白结合口袋,再利用LC-MS去寻找标记位点或肽段,从而提供肽段或残基分辨率的结合位点信息。然而,由于PAL探针与蛋白是按照一定的化学计量比进行结合的,所以产生的标记信号和序列覆盖都非常有限。除此之外,每个PAL探针都有不同的二级碎裂模式,使质谱分析复杂化。基于此,David
W. C. MacMillan团队开发了一种稳健且通用的光催化标记方法来定位蛋白结合位点。
如图1B所示,活性分子上连接有具有光催化功能的标签(Catalytic tagging),本文使用的是铱光催化剂。活性分子-铱光催化剂偶联物能够靶向至蛋白的结合口袋,在可见光的照射下,铱通过能量转移的方式催化附近的双吖丙啶探针生成卡宾自由基,卡宾自由基能够与邻近的氨基酸残基发生反应,从而实现结合口袋的邻位标记。值得一提的是,这种独特的μMap光催化临近标记法将靶向定位和邻近标记分配给不同的分子去完成,邻位标记不受限于靶向定位所需要满足的化学计量比的要求,可实现多个邻近位点的标记,具有信号放大的效果。此外,所有活性分子-铱光催化剂偶联物都可以配合使用统一的邻位标记探针,具有一致二级碎裂模式,有助于简化后续LC-MS数据分析。
图1 μMap光催化邻近标记法原理
图3 μMap光催化邻近标记法用于A)(+)-JQ-1与BRD4;B)dasatinib与BTK;C)AT7519与CDK2;D)lenalidomide与CRBN;E)FKBP12-rapamycin-mTOR蛋白复合物结合位点的鉴定。
以上均是在已知结合位点的蛋白-配体模型中开展的方法学验证实验,后续作者还将μMap光催化临近标记法应用到难成药靶点STAT3。MM-206是STAT3的小分子抑制剂,在临床前疾病模型研究中显示出较好的抗STAT3活性,但到目前为止还没有STAT3与MM-206结合的晶体结构报道,也没有关于MM-206与STAT3结合位点的信息。在本文中,μMap光催化临近标记的结果显示MM-206主要是结合在STAT3的CCD结构域上,大致在Q198和V291位点附近,属于一种变构调节剂(图4A-B)。最后,作者进一步探究了μMap光催化临近标记法在活细胞水平上的标记能力。如图C-E,使用μMap光催化临近标记法成功找到了(+)-JQ-1的结合蛋白:BRD2、BRD3及BRD4,并定位到了(+)-JQ-1与BRD4结合位点,大致在V90、K91、W81氨基酸残基附近。
图4 μMap光催化邻近标记法用于A-B)MM-206与难成药靶点STAT3结合位点的鉴定;C-E)组学样品中小分子(+)-JQ-1结合蛋白的鉴定及结合位点的锁定。
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