分享一篇发表在PNAS上的文章，题目为“Lysosome-targeted multifunctional lipid probes reveal the sterol transporter NPC1 as a sphingosine interactor”。脂质的稳态调节对于细胞的增殖是至关重要的，其中，溶酶体作为细胞内大分子物质分解消化的重要场所，参与了多种脂质的运输、利用和循环。溶酶体功能发生障碍时，可能会引起脂质在溶酶体内异常贮积，导致严重的人类疾病。其中，对于溶酶体外排胆固醇的机制已经被研究的相对透彻了，而其他脂质，特别是鞘氨醇的外排机制还没有得到很好的研究。为了克服这一知识差距，作者开发了能够跟踪鞘氨醇和胆固醇的代谢、蛋白质相互作用和亚细胞定位的功能化的探针。

溶酶体靶向pac鞘氨醇(Lyso-pacSph)和pac胆固醇(Lyso-pacChol)探针的合成与表征

作者设计了Lyso-pacSph和Lyso-pacChol探针具有以下四个特点： i)光激活的双氮嘧啶环，用于紫外线依赖的光交联，ii)可“click”的炔基，允许脂质与荧光团或生物素的交联后功能化，iii)光笼基团(cage)，iv)溶酶体靶向基团，这种靶向基团以质子化形式保留在晚期内体和溶酶体的酸性环境中。这种设计能确保所有探针分子在光照释放活性脂质之前被递送到溶酶体。因此，作者在合成了具有光笼基团的溶香豆素的基础上添加了一个连接体来结合靶向基团，最后pacSph和pacChol分别通过氨基甲酸酯和碳酸酯与它偶联，获得Lyso-pacSph和Lyso-pacChol。

在合成化合物后，作者首先验证这两种探针在60分钟内均容易被HeLa细胞吸收，其中Lyso-pacChol显示出立即的囊泡定位，而Lyso-pacSph则分布在所有细胞膜上。接下来，作者延长探针孵育时间来进一步观察Lyso-pacSph的亚细胞定位。作者发现Lyso-pacChol在所有观察时间内都位于囊泡中，但Lyso-pacSph在18 h后才获得囊泡定位。同时作者发现溶酶探针的荧光与LysoTracker™信号完全重叠也证实Lyso-pacSph和Lyso-pacChol能正确靶向溶酶体。

考虑到需要很长的时间才能达到最佳的Lyso-pacSph溶酶体定位，作者接下来研究了溶酶探针的稳定性。为此，作者将两种探针与Hela细胞孵育24h后提取脂质，并通过“click”化学反应将荧光团添加到炔基上。TLC分析显示，在24小时内没有出现额外的条带，证实溶酶探针在笼状状态下是惰性的。最后，作者通过逐步增加紫外光照时间考察溶酶体探针的光裂解效率。TLC分析显示，60到90秒足以光裂解几乎所有探针分子，释放活性脂质物质。

Lyso-pacSph和Lyso-pacChol在溶酶体蛋白-脂质相互作用研究中的适用性

作者将原来的pacSph和pacChol探针与新合成的溶酶探针进行了比较，通过代谢标记、光解和光交联反应可视化它们的亚细胞定位，然后通过荧光团的“click”反应固定和染色它们的定位，最后利用荧光链亲和素显示所有生物素化的蛋白-脂复合物。对比发现，有几个条带只能用溶酶体探针检测到，这突出了这种探针捕捉稀少或短暂相互作用的敏感性。

接下来，作者通过已知的溶酶体蛋白来验证上述的工作流程是否可以特异性地检测溶酶体蛋白-脂质相互作用。在pacChol和Lyso-pacChol处理的样品的洗脱物中，作者均检测到了已被广泛研究的溶酶体胆固醇结合蛋白NPC1、LAMP1和LIMP-2/ SCARB2，这支持所建立的工作流程可以特异性地检测溶酶体蛋白-脂质相互作用。

进一步地，作者探索了Lyso-pacSph是否能够与内质网驻留蛋白神经酰胺合成酶（CerS5)相互作用。Sph是CerS5的底物，在pacSph处理过的样品的洗脱部分中检测到CerS5。然而，Lyso-pacSph光照后立即收集的样品(0 min)在洗脱分数中未发现CerS5，然而，光照后孵育15分钟则可以在洗脱部分中再次检测到CerS5，这表明Lyso-pacSph探针成功转运到ER。总之，这些数据突出了溶酶探针在空间和时间控制下特异性检测脂质相互作用蛋白的适用性。

Lyso-pacSph和Lyso-pacChol的化学蛋白质组学分析

作者使用定量蛋白质组学来分析洗脱液。对于Lyso-pacChol处理的细胞，作者在12个候选物中发现了已知的溶酶体胆固醇相互作用物，如NPC1和LAMP1，而pacChol探针只能识别出其中6个。Lyso-pacSph处理过的样品只有6种蛋白质，作者推测其中两个胆固醇转运蛋白NPC1和LIMP-2/SCARB2是潜在的Sph相互作用物。接下来，作者通过免疫沉淀和western blot分析验证了Sph与NPC1和LIMP-2/ SCARB2的相互作用。进一步地，作者进行竞争实验，高达50倍过量胆固醇的竞争只能部分取代检测到的NPC1-Sph交联。这些数据提示Sph和胆固醇可能共享一个共同的结合位点，且Sph可能优先与NPC1相互作用。

溶酶体胆固醇和鞘氨醇的代谢命运

接下来，作者研究了新发现的Sph相互作用物NPC1和LIMP-2/SCARB2是否影响溶酶体后胆固醇和Sph代谢的动力学。作者在WT、NPC1^−/−和LIMP-2/SCARB2^−/−HeLa细胞中释放了两种溶酶探针，并通过薄层色谱分析了不同时间的探针代谢物。Lyso-pacChol标记的细胞显示出胆固醇酯的时间依赖性增加。在NPC1^−/−和LIMP-2/SCARB2^−/−HeLa细胞中，这种胆固醇向胆固醇酯的进行严重减少和延迟，表明在这些条件下胆固醇的溶酶体输出缺陷。用Lyso-pacSph标记的WT细胞表现出极快的代谢转化，在最早的时间点产生一小部分标记的磷脂酰胆碱。相反， NPC1^−/−细胞显示出延迟的Sph水平下降，这与运输缺陷一致。另一方面，LIMP-2缺陷细胞仅表现出轻微延迟的Sph输出动力学。总而言之，溶酶体蛋白NPC1和LIMP-2/SCARB2的缺失共同显著影响溶酶体后胆固醇代谢，而Sph代谢通常进行得更快，更依赖于NPC1。

NPC1和LIMP-2/ /SCARB2缺陷细胞中鞘氨醇和胆固醇在细胞器中的溶酶体表达和亚细胞定位

作者利用可“click”反应在实验中附加一个荧光团作为另一个报告分子，在Lyso-pacChol标记的WT细胞中，0分钟时可见主要的溶酶体定位，随后在30分钟后与细胞膜、高尔基体和质膜共定位。在60至90分钟时，一些探针定位于脂滴。缺乏NPC1的细胞显示溶酶体中Lyso-pacChol探针的显著保留长达90分钟。另一方面，LIMP2/SCARB2^−/−细胞表现出一种中间表型，其内膜染色的动力学与WT细胞相似，但在90分钟是也能看到一些溶酶体。这可能指向不同的溶酶体群体，一个群体具有功能性胆固醇输出途径，而较小的群体具有由LIMP-2/SCARB2介导的缺陷胆固醇输出。双NPC1/LIMP-2敲除细胞系在整个时间过程中溶酶体共定位显示出与单一NPC1^-/-细胞系相当，再次支持溶酶体胆固醇的主要出口途径依赖于NPC1。

接下来，作者利用Lyso-pacSph研究了尚未探索的Sph溶酶体输出。在WT细胞中，Sph在30分钟后从溶酶体重新定位到主要的高尔基膜，而后信号强度丢失，与鞘氨醇探针的外排或有效分解代谢一致。在NPC1^−/−细胞中，溶酶体在整个时间过程中染色，只有一小部分探针定位到其他细胞膜，存在Sph储存表型。LIMP-2/ SCARB2^−/−细胞再次显示出一种中间表型。有趣的是，双NPC1/LIMP-2敲除细胞系在整个时间过程中几乎都具有完全的溶酶体定位，且皮尔逊系数一直很高，这表明两种敲除具有潜在的叠加效应。总之，这些数据显示先前已知的胆固醇转运体NPC1和LIMP-2/SCARB2的缺乏也会影响Sph输出。

鞘磷脂转运缺陷是NPC1功能障碍的直接后果

为了排除观察到的现象是NPC1^−/−细胞系长期适应引起的下游效应，作者接下来使用药理抑制剂U1866A进行了评估。在存在U18666A的情况下重复之前的实验，与WT细胞相比，溶酶体的Sph输出呈现程度略低于基因敲除模型的延迟。为了验证所观察到的Sph储存是由于NPC1缺失引起的主要影响还是由NPC1诱导的胆固醇积累和溶酶体输出Sph能力的潜在降低造成的次要影响，作者在缺乏脂蛋白的培养基中培养NPC1^-/-细胞，使其处于饥饿状态。filipin染色显示，这种处理显著降低了溶酶体胆固醇水平，在这些条件下Sph仍然被困在溶酶体中，其程度与非饥饿的NPC1细胞相同，这表明NPC1在Sph运输中起直接作用。先前的研究表明，NPC1参与溶酶体与内质网细胞器接触位点的建立和维持，缺乏NPC1以及使用U18666A进行药物抑制都会降低溶酶体与内质网接触位点的程度。

为了梳理NPC1是作为Sph转运体还是接触位点系链的作用，作者使用了已发表的NPC1变体(L472P)，该变体被证明保留转运体功能而不具备系链作用。功能性NPC1能够挽救NPC1-KO细胞中所见的Sph积累，而突变体(L472P)显示鞘氨醇探针的溶酶体染色时间延长。这表明Sph通过NPC1形成的分子间通道排出溶酶体。

最后，作者在WT背景下人工增加溶酶体脂质水平重建NPC1样表型，以研究两种脂质之间是否存在优先转移。为此，作者合成了新的溶酶体预定位探针Lyso-Sph和Lyso-Chol，这些探针只具有光笼基团和溶酶体靶向集团。将这两种探针结合使用，光照后，两种脂质类型同时释放，但仅通过原来能发生“click”反应的探针来定位溶酶脂质。Pearson相关系数对鞘氨醇探针和LAMP1的共定位分析显示，在胆固醇过量或不过量的情况下，Sph输出没有可检测到的差异。然而，当倒置实验时，作者检测到Sph存在时胆固醇输出的延迟，这些数据进一步支持在NPC1 ^-/-细胞中观察到的Sph储存表型以及在较小程度上在LIMP-2^-/-细胞中观察到的Sph储存表型不是胆固醇积累的次要后果，而是溶酶体Sph浓度的增加诱导了NPC1/LIMP-2样胆固醇输出延迟，可能是由于Sph与这些蛋白的优先相互作用。

在本篇研究中，作者将三功能脂类的概念与细胞器靶向相结合，以实现对这些探针的精细时空控制。在溶酶体内的脂质预定位后，探针由于光笼基团处于非活性状态，通过光照快速转化为活性形式，预定位的脂质在笼子状态下承受水解酶长达24小时的巨大稳定性使得实现专属的细胞器定位。此外，通过Lyso-pacSph，作者发现，与胆固醇类似，Sph与溶酶体相互作用并可能通过NPC1输出溶酶体，在较小程度上也通过LIMP-2/ SCARB2，可能是利用它们的疏水通道将其输送到溶酶体膜。

本文作者：ZQ

责任编辑：LRC

DOI: 10.1073/pnas.2213886120.

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2213886120