分享一篇发表在Nature Communications上的文章，题目为1,2,4,5-Tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity.1,2,4,5-四嗪-乙醚探针超高特异性荧光成像活细胞中的超氧化物。

活性氧 （ROS） 包括多种不稳定、氧化和短寿命的氧衍生物。它们结构和反应性十分相似，使得单个特异性ROS的检测极具挑战性。为了准确阐明各种ROS在生理学和病理学中的多效性作用的分子机制，并将氧化还原信号转化为有效的治疗方法，必须开发强大的工具，专门检测目标的ROS，同时对其他ROS保持沉默。

理想情况下，在具有理想时空分辨率的活细胞中，超氧化物（O2-）可能是最重要的ROS。超氧化物由多种酶产生，例如线粒体电子传递链（ETC）和NADPH氧化酶（NOX）。它通过超氧化物歧化酶 （SOD）歧化，产生 H2O2 和其他用于氧化还原信号传导的 ROS（图 1A）。

图1

A）超氧化物作为细胞中的主要ROS；

B）各种活性氧的反应性。

不平衡的超氧化物稳态会引发氧化应激，与衰老、癌症、神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等有关。鉴于超氧化物在氧化还原信号传导和氧化还原稳态中的关键作用，超氧化物的特异性检测长期以来一直是吸引持续研究的热点。

在这些不同的方法中，最理想的是荧光成像。荧光探针二氢乙锭（DHE）及其线粒体锚定的类似物MitoSOX已成为生物学中检测超氧化物的最常用工具。蓝光发射DHE容易被超氧化物氧化，形成红色发光产物。因此，记录细胞中红色荧光的总强度已被常规用于评估细胞超氧化物的产生。但也有研究表明，DHE也可以被其他ROS氧化形成红色发射产物，干扰超氧化物的成像。

文章中，研究人员报告了一系列ABS探针的设计和开发，以高效的特异性对活细胞中的超氧化物进行成像。这些探针是基于超氧化物的还原性质开发的，并利用从超氧化物到1,2,4,5-四嗪（Tz）的单电子转移作为响应机制。由于Tz固有的荧光猝灭能力，这些探针对超氧化物表现出超荧光反应。

不同的灵敏度及其不同的发射颜色使活细胞中超氧化物水平的多重成像成为可能。研究人员设计了一个探针，Tz被拴在萘（F-Tz1，F-Tz2）或喹啉荧光团（F-Tz3，F-Tz4）的C-2位置（图2A）。同时，文章通过实验证明，所有这四种探针的荧光强度都取决于超氧化物的剂量（图2D），并且它们的荧光反应对超氧化物具有高度特异性，其他生物相关物种几乎没有产生干扰。这种特异性优于商业探针DHE和DCFHDA。DHE被认为是超氧化物特异性探针，DCFHDA是非选择性ROS探针。并且有实验表明，DHE和DCFHDA都可以被各种ROS物种打开，表现出较差的选择性（图2E）。

图2

研究人员注意到，基于Tz的探针除了具有理想的选择性外，还表现出比DHE和DCFHDA更好的储存稳定性。

在细胞成像之前，研究人员进行细胞活力测定以确认这些探针的安全性。通过在烧瓶中用超氧化物处理探针，制备的恶二唑衍生物显示出可忽略不计的细胞毒性，然后评估它们在检测活细胞中超氧化物方面的性能。为了诱导细胞超氧化物的稳健上调，用H2O2（2 mM）刺激HepG2细胞，控制不同的诱导时间。研究人员通过荧光光谱和LC-MS分析确认，即使在如此高的浓度下，H2O2也无法与基于Tz的探针发生反应。

将细胞用探针染色30分钟，并在共聚焦显微镜下成像。除F-Tz3外，所有探针都能够在HepG2细胞中成像超氧化物（图2F），并且它们的荧光强度与H2O2孵育时间呈正相关。基于亮度数据，在随后的研究中使用了高发光蓝色探头F-Tz1和绿色探头F-Tz4。

经历氧化应激的活细胞不可避免地表达多种ROS。因此，单个ROS的特定探针非常急需。为了确认F-Tz1和F-Tz4对活细胞中超氧化物的特异性，研究人员使用了超氧化物特异性清除的方法。Tiron和TEMPO是两种有效清除超氧化物的试剂。然后将这两种试剂用于H2O2处理的细胞中，以降低细胞超氧化物水平。因此，Tiron和TEMPO都有效地抑制了探针F-Tz1和F-Tz4在这种活HepG2细胞中的荧光反应。相比之下，它们仅部分抑制了DHE和DCFHDA的荧光反应。这些结果符合基于Tz的探针对超氧化物的选择性优于DCFHDA和DHE，并突出了基于Tz的探针F-Tz1和F-Tz4在细胞超氧化物成像方面的高效特异性。

本文作者：TZM

责任编辑：TZM

DOI: 10.1038/s41467-023-37121-8

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37121-8