分享一篇发表在Nature Communications上的文章,题目为“Secretory GFP reconstitution labeling of neighboring cells interrogates cell–cell interactions in metastatic niches”。癌细胞在转移定植过程中不可避免地与邻近的宿主组织驻留细胞相互作用，建立转移生态位以促进其存活、生长和侵袭。然而，由于缺乏全面研究生态位中细胞间相互作用机制的方法学，转移性生态位的潜在机制尚未完全阐明。在这里，作者改进了一种基于绿色荧光蛋白（GFP）的遗传编码系统，开发分泌型糖基磷脂酰肌醇锚定的重组活化蛋白，以突出细胞间连接（sGRAPHIC），用于有效荧光标记组织驻留细胞，这些细胞与深部组织中的癌细胞相邻并推测与之相互作用。sGRAPHIC系统能够使用单细胞RNA测序平台分离转移性生态位相关组织驻留细胞以进行表征。作者使用sGRAPHIC的转录组学平台来揭示肝转移小鼠模型中转移性生态位相关肝细胞的基因表达模式。在转移性生态位相关肝细胞的标记基因中，作者发现编码半乳糖凝集素-3的Lgals3是加速转移性生长和侵袭的潜在促转移因子。

作者推测，GRAPHIC在癌细胞中的低效荧光标记是由于癌细胞的细胞间粘附不稳定。为了实现涉及癌细胞的细胞间相互作用的有效光学标记，使用GPI锚定的N端和分泌型C端GFP片段的组合构思了sGRAPHIC（如图1）。为了开发sGRA

为了测试sGRAPHIC的邻近细胞标记，作者建立了稳定表达sGRAPHIC报告基因的HEK293T细胞。当GFP与稳定表达sC-GR（HEK293T/sC-GR）的HKE293T细胞共培养24小时时，无论细胞比例如何，GFP在稳定表达N-GR（HEK293T/N-GR）的相邻HEK293T细胞上成功重组。为了证明sGRAPHIC标记各种癌细胞-组织-驻留细胞相互作用的多功能性，作者建立了稳定表达sC-GR（MC-38/sC-GR）的小鼠乳腺癌细胞系E0771（E0771/sC-GR）和小鼠结肠癌细胞系MC-38。当表达N-GR的组织驻留细胞系与表达sC-GR的癌细胞以1：1的比例共培养24小时时，荧光共聚焦显微镜观察和流式细胞术分析证实，组织驻留细胞选择性地用GFP高效标记。与共培养评估中6小时的流式细胞术分析一致，延时荧光成像显示，在共培养癌细胞和成纤维细胞后约3小时可检测到GFP信号。为了观察sC-GR从癌细胞中扩散，作者以1：50的比例共培养癌细胞和成纤维细胞24小时。该测定表明，在距离癌细胞一层或两层细胞的范围内观察到GFP标记的成纤维细胞（如图2）。总体而言，结果表明sGRAPHIC适用于荧光标记各种细胞类型和物种的相互作用细胞。

接下来，作者通过使用携带N-GR的腺相关病毒血清型8（AAV8/N-GR）将N-GR基因转导到肝脏驻留细胞中来检查体内sGRAPHIC标记。将E0771/sC-GR细胞脾内注射到AAV8/N-GR处理的小鼠中证实，GFP标记的mCherry阳性细胞存在于转移性集落-肝组织的边缘区域。此外，sGRAPHIC标记偶尔会延伸到多个细胞层，并且计算出标记的最大距离为99.7±3.4μm。总的来说，作者得出结论，sGRAPHIC策略在转移期间与癌细胞近端相互作用的组织驻留细胞的荧光标记中是成功的。为了探究肝转移生态位的机制作用，作者将sGRAPHIC与scRNA-seq相结合，构建了一个转录组学平台，名为Highlighting Unknown Neighbors Through Extracellular-gfp Reconstitution and Sequencing（HUNTER-seq）。在E0771/sC-GR细胞注射三周后从肝脏中分离并测序了GFP+mCherry+（近端）肝细胞、GFP-mCherry+（远端）肝细胞，以及从健康肝脏中取出的GFP-mCherry+肝细胞（对照）在死细胞排除后。差异基因表达分析检测到转移肝脏的肝细胞（近端和远端）与健康肝脏的肝细胞（对照组）相比，Saa1和Lcn2的上调。据报道，在先前的一项研究中，这些分子始终上调，该研究描述了由肿瘤细胞的可溶性因子刺激的肝细胞的反应。近端肝细胞对远端和对照肝细胞表达的标记基因的基因本体分析表明，近端肝细胞的特征是应激反应和肝代谢功能丧失（如图3）。此外，近端肝细胞强烈激活核糖体生物发生相关特征，这是细胞生长和增殖的标志。总体而言，HUNTER-seq成功捕获了转移性生态位细胞，并揭示了近端肝细胞的独特基因表达特征。

图 3