分享一篇最近发表在CCS Chem.上的文章，Cysteine-Specific Bioconjugation and Stapling of Unprotected Peptides by Chlorooximes。这篇文章的通讯作者是来自南京大学的王欢教授。

    环肽由于其独特的拓扑结构和化学性质，是一种很有前景的生物分子结合剂和成药分子。与线性肽对应物相比，环肽通常具有更高的靶标特异性和亲和力、增强的蛋白水解抗性和细胞通透性。近年来，为了发展环肽药物分子，研究者们利用蛋白质表位模拟策略或者使用体外展示技术对组合环肽库进行高通量筛选，而后一种策略通常需要在生物相容的条件下有效地交联多肽中的两个氨基酸。

    目前研究人员已经发展了许多基于半胱氨酸（Cys）的多肽装订（Stapling）试剂，生成的连接子的结构如图1a所示。尽管如此，我们仍然需要发展更高效的、结构更丰富的、并有可能产生生物学功能的Cys特异性装订试剂。巯基肟这种结构含有四种不同的原子，在某些天然产物和酶中存在（图2a）。在本文中，作者报道了氯肟作为一种高效的多肽偶联和装订试剂，可以在中性水溶液中生成稳定的巯基肟键，生成具有结构和拓扑多样性的环肽。

图1. (a)代表性的半胱氨酸装订试剂形成的连接物；(b)含有巯基肟的天然产物和酶偶联物；(c)利用氯肟偶联多肽；(d)由多官能团氯肟生成环肽

    为了评价氯肟作为多肽偶联试剂的潜力，作者以苯甲羟肟氯酸为模型化合物，与半胱氨酸衍生物在HEPES缓冲液中孵育。结果表明，该反应可以在1分钟内定量转化，并且在pH从5到9的范围都可以高效进行。除半胱氨酸外，其他具有亲核性基团的氨基酸如赖氨酸、酪氨酸等不会与苯甲羟肟氯酸发生反应，表明该反应具有较高的特异性和选择性。作者接着验证了连接子巯基肟的稳定性，HPLC表征证明巯基肟在水溶液中以及游离巯基存在时都可以保持稳定。

    氯肟对Cys残基的反应性和选择性促使作者探索双官能团氯肟在肽装订中的应用，作者以双氯肟1b与含有双巯基的七肽底物2e在中性缓冲条件下孵育10分钟（图2a），作者用HPLC和MS等手段证明了环肽的生成。接着作者拓展了底物的范围，对不同的含有双半胱氨酸残基的多肽都实现了装订；作者还合成了三氯肟的试剂1c，证明了其可以与三半胱氨酸残基的底物生成双环肽。对于N端半胱氨酸，它可以与氯肟进一步反应环化生成4,5-二氢噻唑结构，进一步拓展了环肽产物的结构多样性。

图2. 由多官能团氯肟实现多肽装订

    最后，作者探究了双官能团氯肟在两个蛋白质片段之间偶联的适用性。作者以山羊抗人IgG抗体的抗原结合片段（Fab）为模型蛋白，Fab含有两条链，两条链由一个二硫键连接。作者将其还原后使用双氯肟1b进行偶联，SDS-PAGE结果表明，经过偶联后的Fab不会再被还原成两个单体。

图3. 双官能团氯肟实现蛋白二硫键桥连

    总的来说，在本文中作者证明了氯肟可以作为半胱氨酸特异性生物偶联试剂，用于多肽修饰偶联和大环化。氯肟制备方便，可以与半胱氨酸残基生成稳定的巯基肟结构，反应具有较高的化学选择性。此外，氯肟与1,2-氨基硫醇和炔烃的多种反应方式进一步扩大了环肽的结构多样性。氯肟与半胱氨酸的反应还可能与噬菌体和mRNA肽展示等体内肽展示技术相结合，用于构建环肽文库，以筛选得到具有特殊功能的环肽。

作者：ZHS    审校：SYM

DOI: 10.31635/ccschem.021.202101386

Link: https://doi.org/10.31635/ccschem.021.202101386