推荐一篇发表在Nat. Commun.上的论文，题目为“Fluorogenic CRISPR for genomic DNA imaging”，通讯作者是来自中国科学院北京生命科学研究院的李幸教授，李幸教授课题组主要致力于核酸化学生物学研究；基于CRISPR技术的成像与调控; 以及小分子探针和药物等相关研究。人类基因组DNA和染色体功能与高度动态的亚细胞定位是密切相关，因此需要有效的成像工具来揭示这种时空信息。基于CRISPR技术的成像方法可以成像活细胞中的基因组位点：Cas9可以高精确性地靶向特定基因组位点，因此在催化失活的 Cas9 (dCas9)上融合荧光蛋白即可实现成像目的；或者构建sgRNA招募的融合有荧光蛋白的RNA结合蛋白也可以作为成像工具。然而这些技术都存在着一些问题，除了特异性结合基因组位点的荧光蛋白会产生较强的荧光信号，同时也会存在未与基因组位点结合的荧光蛋白，他们分布在整个细胞核，势必会产生很强的荧光背景，因此这些方法具有较低的信噪比。
因此在这项工作中，作者开发了一种用于基因组DNA成像的基因编码荧光CRISPR(fCRISPR)系统，具有低背景荧光和高荧光激活等特性。该方法是在荧光蛋白上融合一段不稳定降解元件(tDeg)，该蛋白可以与Pepper RNA结合后将该元件掩盖起来从而避免降解。因此作者通过在sgRNA中引入Pepper发卡结构来有针对性地使荧光信号定位到sgRNA上，以此来减少核内游离的荧光蛋白的荧光。为实现这一目标首先作者构建了三个质粒：融合有Pepper发卡结构的sgRNA；绿色荧光蛋白融合的dCas9 (dCas9-GFP)；融合有降解元件的荧光蛋白（tdTomato-tDeg报告）。将上述三种质粒转染到细胞中，我们可以看到，dCas9-GFP成像基因组位点的荧光信号较强，但是背景很高，在细胞核弥漫着绿色的荧光信号；而作者开发的成像工具具有非常优异的信噪比，并且红色荧光斑点与dCas9-GFP的绿色荧光斑点共定位效应很强，且仅在表达sgRNA时发生。
接下来作者还将其扩展了不同的成像颜色，将tDeg融合不同颜色的荧光蛋白，所有荧光原蛋白都显示有效标记和高信噪比。除此之外，作者还将此工具与其他的成像工具联合使用，可以实现不同DNA的正交成像。除此之外，作者还将该技术用于追踪活细胞中染色体的动态过程，作者在细胞中表达了靶向3号染色体的fCRISPR，并进行了高频共聚焦显微镜成像。在细胞中观察到fCRISPR报告的三个荧光斑点，作者分别对这三个目标轨迹上进行了单粒子轨迹跟踪。为此作者还用具有微观扩散系数(MICO)的均方位移(MSD)曲线来描述这些受限运动。结果表明3号染色体的运动是高度受限和不均匀的。总之，作者开发的fCRISPR工具可以以高信噪比和高灵敏度对不同人类细胞中的各种基因组DNA进行了成像。本文作者：ZJ
责任编辑：WYQ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-45163-9
文章引用：10.1038/s41467-024-45163-9
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