RNA结合蛋白（RBP）是真核生物中调控基因表达的关键成分。RBP和RNA之间的相互作用在调控RNA的成熟、稳定、定位、编辑和翻译中起着至关重要的作用。由于转录后调控通常发生在由膜分离和相分离形成的特定亚细胞区室中，RBP的功能也受其亚细胞定位的影响。RBP亚细胞定位的严格调控可以被认为是控制细胞生理的一个重要层面。因此，全面鉴定特定亚细胞区室中的RBP并量化其在细胞应激下的动态变化，对于阐明其在生物功能和病理过程中的调节作用具有重要意义。2024年1月29日，国家蛋白质科学中心（北京）、医学蛋白质组全国重点实验室秦伟捷课题组在Nature Communications杂志在线发表了题为“Nuclear and cytoplasmic specific RNA binding proteome enrichment and its changes upon ferroptosis induction”的研究论文。该研究发展了多种亚细胞特异性RNA标记探针，用于高效富集和深入分析细胞核和细胞质RBP（图1），并首次开展了铁死亡诱导下亚细胞特异性RBP-RNA相互作用的组学水平研究。该探针由三部分组成：用于RNA标记的尿嘧啶光反应性呋喃香豆素基团，用于细胞核/细胞质定位的亚细胞靶向肽和用于富集的生物素基团。首先，通过孵育使探针进入细胞并定位到细胞核或细胞质区域。然后，分别用254 nm和365 nm紫外光交联RNA和RBP，并使探针通过呋喃香豆素基团与尿嘧啶的光催化环加成反应标记在RNA上。细胞裂解后，利用链霉亲和素磁珠富集交联的RNA-蛋白复合物（RPC），并进行RNA测序或质谱分析。
图1 基于亚细胞特异性RNA标记探针的RPC规模化研究方法
所用核、质探针体现出了高精度的细胞器定位（图2）。共计鉴定了1221个细胞核RBP和1333个细胞质RBP，覆盖了大多数已被报道过的细胞核、质RBP，并分别比以往报道的富集结果增加了54.4%和85.7%。RBP通路、GO分析和RNA测序验证了富集结果的特异性和亚细胞定位的准确性。进一步分析发现RBP与RNA的互作具有明显的细胞器特异性，79.9%的互作仅发生在细胞核或质中（图3），对于研究RBP的亚细胞定位相关功能及其在扰动下的动态变化至关重要。
图2 细胞核、质探针的细胞器定位成像分析
随后，作者研究了早期铁死亡对亚细胞特异性RNA-RBP相互作用的影响。通过三种铁死亡诱导剂从不同代谢通路诱发早期铁死亡。发现erastin诱导后，细胞核中RBP与RNA互作发生上调，而在细胞质中显著下调；同样，在RSL3诱导的细胞中，细胞质中也发现了大规模下调；而DAT诱导的影响较小（图4），表明三种诱导剂可能通过不同的途径干扰细胞核、质中的RNA-RBP互作。在Erastin和RSL3诱导下，细胞核中与RNA结合上调和细胞质中与RNA结合下调的RBP与GO条目“翻译”高度相关，表明在早期铁死亡时，翻译相关的RBP在细胞核中与RNA结合增强，在细胞质与RNA结合减弱。其中，59个RBP同时表现出细胞核上调和细胞质下调，被认为是核质易位候选者。其中有三分之一参与“代谢”途径，包括三羧酸(TCA)循环，为研究它们在铁死亡诱导的代谢失调中的可能作用提供了新思路。
图4 不同铁死亡诱导剂引发的细胞核、质中RBP与RNA互作变化
综上所述，该研究描述了一种基于光催化反应的亚细胞特异性RNA标记策略，成功用于细胞核、质RBP的规模化富集，在铁死亡早期阶段观察到亚细胞RBP-RNA互作的大规模变化，发现了数十个核质易位候选RBP，并通过免疫荧光成像对部分代表性RBP的细胞器定位变化进行了验证。
博士后孙浩帆博士为文章的第一作者，秦伟捷研究员为文章的通讯作者。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-44987-9
责任编辑：WFZ
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