分享一篇发表在Nature communications上的文章，题目为“Regulating protein corona on nanovesicles by glycosylated polyhydroxy polymer modification for efficient drug delivery”。 文章的通讯作者是来自中国科学院上海药物研究所张馨欣研究员与甘勇研究员，张馨欣主要从事新型功能性脂质制剂研究，甘勇主要开展新型药物释放技术的研究。
当纳米载体进入人体后，许多血浆蛋白(如血清白蛋白、免疫球蛋白、粘附介质和补体成分)会吸附在纳米载体表面，形成蛋白质冠，并改变纳米载体的生物学特性及体内转运行为。此外，纳米载体在不同的生理环境中运输时，形成的蛋白质电晕随着时间的推移而动态交换。动态蛋白电晕诱导免疫系统对纳米载体的识别和清除，并阻碍所需靶细胞群的摄取，这是纳米载体从实验室到临床转化的主要障碍。研究表明，纳米载体的表面修饰对蛋白质的吸附有显著的影响。聚羟基聚合物的修饰可以最大限度地减少蛋白质的吸附，可逃避先天吞噬细胞的识别，并延长血液循环时间。但是，有文献报道聚乙二醇化的纳米载体很容易触发抗聚乙二醇抗体的产生，重复给药可加速血液清除。大多数PEG修饰策略不能完全消除蛋白质冠状病毒诱导的免疫清除。与此同时，亲水聚合物修饰也会限制靶细胞对纳米载体的细胞摄取。受纳米载体与蛋白相互作用影响细胞内化的启发，研究人员试图调节蛋白质冠的形成，以提高肿瘤细胞对纳米载体的吸收，如用青霉胺功能化的纳米颗粒来吸附各种癌细胞上过表达的转铁蛋白并与转铁蛋白受体相互作用；用健康小鼠的蛋白冠状体预先包裹转铁蛋白修饰的纳米颗粒可显著增强对肿瘤细胞的主动靶向能力。此外，羟基和氨基是连接蛋白质-受体或药物-靶蛋白的氢键的关键组成部分，羟基和氨基可以赋予纳米载体亲水性以减少非特异性蛋白质的吸附，这可能为聚合物修饰以调控纳米载体与蛋白质相互作用提供一种方法。受氨基酸修饰影响蛋白质吸附和生物效应的官能团的启发，通过壳聚糖低聚糖(CSO)和PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物(TCP)接枝合成了糖基化多羟基聚合物(CSO-G-TCP)，并将其修饰在脂质纳米囊泡(CP-LVS)上，可赋予不同氨基/羟基比例的纳米载体表面。CP1-LV用于研究受功能基团差异影响的蛋白冠组成和受蛋白冠影响的纳米囊泡运输(图1)。具有适当氨基/羟基比例(CP1-LV)的CPLV有望减少血浆和肝脏中动态蛋白冠的形成，从而阻止免疫激活和ABC效应。同时，在纳米囊泡从血液到肿瘤的运输过程中，CP1-LV可以动态吸附大量肿瘤相关蛋白，如CD44和低等电点骨桥蛋白(OPN)，这些蛋白可以与CP1-LV的氨基结合，从而提高肿瘤细胞的选择性摄取。由于CP1LV具有较强的延长血液循环和促进肿瘤细胞内化的能力，因此，紫杉醇(PACLITAXEL, PTX)负载CP1LV有望在荷瘤小鼠中发挥出色的抗肿瘤功效。
图1用不同比例的氨基和羟基修饰纳米囊泡，研究纳米囊泡表面动态蛋白冠组成和蛋白冠在体内的影响行为的设计示意图。具有适当氨基/羟基比例的CP1-LV有望通过逃避蛋白质吸附来避免巨噬细胞吞噬，并通过结合肿瘤相关蛋白来增强其在肿瘤细胞中的内化。将PEO20-PPO70-PEO20三嵌段共聚物接枝到CSO的主链上，合成了氨基改性的亲水性聚合。物TCP和CSO在聚合物中的摩尔比分别为4:1、2:1和1:1（分别命名为CSO-G- TCP4、CSO-G- TCP2和CSO-G- TCP1）。将CSO-G-TCP和DPPC水合得到一系列具有球形囊泡结构、平均尺寸约为100 NM的脂质纳米囊泡，称为CP4 - LV、CP2 - LV和CP1 - LV(图2B)。用BOEHM滴定法测定所得CP - LV的氨基和羟基的比例。如图2C所示，CP4-LVS、CP2-LVS和CP1-LVS中氨基/羟基的平均摩尔比分别为0.2、0.3和0.4。氨基和羟基的表面修饰决定了纳米囊泡和蛋白质的相互作用。CP4-LVS、CP2-LVS和CP1-LVS中氨基信号的相对强度以相似的速率下降(图2G)，表明CP-LVS上的氨基离子分布模式相似。这些结果表明，CP1-LV具有覆盖表面最高的氨基强度。此外，CP-LV的zeta电位相似且接近中性(图2h)。到目前为止，作者合成了一系列具有相似大小，zeta电位和形态的稳定且生物安全的纳米囊泡，将氨基和羟基的比例作为后续研究的唯一变量。探讨CP - LV的氨基/羟基比例如何差异调节蛋白冠组成及其生物学行为。
不同的表面修饰在进入生理环境后可能会影响纳米囊泡上蛋白冠的组成。采用BCA法和SDS-PAGE法分析CP-LV与血浆孵育后形成的蛋白冠。PEG-Lips和Lips作为阳性对照和阴性对照;同时，以p-lv为对照组，与CP-LV进行比较，研究纳米囊泡表面功能基团对蛋白冠组成的影响。如图3a所示，Lips吸附了大量的血浆蛋白，导致了血浆蛋白吸附前后纳米囊泡大小变化的明显差异，并且通过多羟基聚合物的表面功能化，显著降低了对血浆蛋白的吸附。增加cp - lv表面氨基的密度可以减少总蛋白质吸附。SDS-PAGE对蛋白冠的分析与纳米囊泡吸附蛋白量的结果一致(图3b)。与CP2 - LV和CP4 - LV相比，CP1 - LV对蛋白质的吸附最低，且大部分条带的强度较弱。为了更深入地了解蛋白质冠的组成，作者用胰蛋白酶消化吸附的分离蛋白，并通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析所得的肽混合物。将鉴定的蛋白质根据其功能分组表明，纳米囊泡上吸附了多种蛋白质，包括血清白蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白和补体蛋白(图3c)。与Lips组相比，载脂蛋白A-I (ApoA1)等脂蛋白很少吸引到PEG-Lips、p - lv和cp - lv的亲水表面，对巨噬细胞吞噬的影响可以忽略不计。PEG-Lips和CP-LV主要吸附白蛋白、纤维蛋白原和各种免疫相关蛋白。吸附在CP-LV上的蛋白质种类与PEG-Lip相似，但含量不同。此外，作者选择了蛋白质组成和数量最高的前20个蛋白质与蛋白质组学指纹图谱进行比较(图3d)。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质之一，在纳米囊泡表面富集，在CP-LV表面的吸附量比在PEG-Lips和p - lv表面的吸附量少。同时，氨基修饰的cp - lv比PEG-Lips吸附更少的免疫应答(图3d)。据作者所知，补体蛋白、免疫球蛋白和巨球蛋白作为免疫反应调理素，参与多种生物功能，包括对纳米载体的识别和清除。据报道，蛋白冠中特异性蛋白(包括IgG和IgM)的富集诱导纳米载体与免疫细胞相互作用，激活免疫系统，导致纳米载体被清除。免疫印迹法进一步检测IgG和IgM的表达水平。PEG-Lips和p-lv吸附了大量的IgG和IgM，而cp - lv对IgG和IgM的吸附随着氨基修饰的增加而减少。与cp2 - lv和cp4 - lv相比，氨基酸密度最高的cp1 - lv对IgG和IgM的吸附最低(图3e, f)。
从血液到肝脏运输过程中纳米囊泡上的动态蛋白质冠状体为了研究不同生理环境下蛋白质在纳米囊泡上的动态吸附，作者将纳米囊泡依次置于血浆、PBS和肝脏TIF中孵育，清晰地观察纳米囊泡上蛋白冠的动态变化过程，包括吸附、解吸和再吸附(图4a)。如图4b所示，PBS洗涤后，纳米囊泡上的血浆蛋白量减少，肝脏TIF孵育后，纳米囊泡上的血浆蛋白量增加。在血浆和PBS孵育的样品中，约70 kDa的蛋白(包括白蛋白)的强烈条带在肝T后显着减少, 而肝脏纳米囊泡上的许多蛋白带明显增加，尤其是40 - 55 kDa之间的蛋白，如IgG(图4c)。这些结果表明，在孵养过程中，白蛋白经历了吸附、解吸和再吸附的过程，而IgG在血浆和PBS中稳定吸附，并在肝脏TIF中大量结合纳米囊泡。值得注意的是，cp1 - lv在血浆和肝脏TIF中几乎没有吸附白蛋白和IgG，其在血浆中的白蛋白吸附比PEG-Lips低2.4倍，在肝脏TIF中的IgG结合比PEG-Lips低2.1倍。一般来说，氨基/羟基比约为0.4的cp1 - lv吸附最低的免疫相关蛋白，包括白蛋白和IgG。
作者进一步研究了纳米载体表面蛋白冠状体对体内血液循环的影响。单次注射纳米载体考察了纳米囊泡和脂质体的药代动力学。如图6a所示，与聚羟基聚合物PEO-PPO-PEO修饰的p - lv在循环系统中的消除速度较慢，接近阳性对照组PEG-Lips密度的增加，cp - lv比p - lv在血液循环中的滞留能力增强。氨基/羟基比最高的cp1lv循环时间明显延长，是PEG-LIPS的2.2倍(图6B)。这可能是由于CP1 - LV在血浆和肝脏中运输时，蛋白质在CP1 - LV上的动态吸附最小，避免了巨噬细胞的活化。据报道，聚乙二醇化的纳米载体可以通过反复给药诱导ABC效应44,45。作者通过反复注射纳米载体的药代动力学来研究蛋白冠对ABC现象的影响。显然，PEGLIPS表现出抗PEG抗体结合引起的ABC现象，与LIPS相似。相比之下，CP1 - LV在或的情况下维持了延长的血液循环。第二次注射时，CP1 - LV的半衰期为41.3 H，是PEG-LIPS的3.8倍(图6A, B)。总的来说，无论单次或多次给药，氨基酸/羟基比例合适的CP1 - LV都能在血液中长期循环。
在A549或HeLa荷瘤小鼠中进一步研究了体内肿瘤间质液中形成的蛋白冠(图9a)。CP1-LV在肿瘤组织中吸附了大部分蛋白质，尤其是对OPN和CD44的吸附(图9b-d)，这可能有利于纳米囊泡向肿瘤的递送。为了研究纳米囊泡的生物分布和肿瘤积累，作者将ir783标记的纳米囊泡静脉注射到荷瘤小鼠体内，并使用IVIS光谱系统进行监测。CP1-LV表现出最高的肿瘤积累，在A549和HeLa肿瘤中，其荧光强度分别比PEG-Lips高2.6倍和2.2倍(图9e-g)。利用CLSM进一步观察纳米囊泡在肿瘤中的生物分布。经PEGLips处理的肿瘤切片图像显示绿色荧光点分散在远离细胞核的地方，而cp1 - lv的荧光信号在肿瘤切片中富集并分布在细胞核周围(图9h, i)。这是由于cp1 - lv吸附了大量的肿瘤基质蛋白，包括OPN和CD44，可以提高纳米囊泡进入肿瘤细胞的内化效率。一般来说，CP1-LV可以避免网状内皮系统的快速清除，选择性地内化到肿瘤细胞中，从而达到最佳的抗肿瘤效果。本研究成功地合成了糖基化多羟基聚合物，制备了不同比例氨基和羟基修饰的纳米囊泡。不同的表面官能团是探索纳米囊泡表面蛋白冠组成及其递送命运的主要变量，特别是血液循环和肿瘤细胞内化。氨基修饰的CP-LV在血浆和肝脏TIF中分别与白蛋白和IgG的结合亲和力降低。氨基酸/羟基比最高的CP1-LV在从血浆到肝脏的运输过程中动态吸附少量蛋白质，特别是IgG/IgM，有助于延长循环。pI低于5.5的蛋白质倾向于与带正电的基团(如氨基)结合。pI小于5.5的肿瘤TIF蛋白，包括CD44和OPN，容易被高氨基/羟基比的cp1 - lv吸附，通过CD44和OPN介导的途径促进肿瘤细胞的纳米囊泡内化。相反，肝脏TIF中pi值高于环境pH值的蛋白质，如IgG，带正电，静电排斥CP1-LV上的氨基。这导致IgG的低吸附和CD44和OPN在CP1-LV上的高结合。
图6
本文作者：WQY
责任编辑：LRC
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-45254-7
DOI：10.1016/j.ijbiomac.2020.12.108
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