分享一篇近期发表Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为Rational Design of L-RNA Aptamer-Peptide Conjugate for Efficient Cell Uptake and G-quadruplex-Mediated Gene Control。文章的通讯作者是香港城市大学的郭骏杰教授。 RNA G四联体（rG4）在多种生理活动中具有重要作用，但这种结构的形成是一个动力学的瞬态行为，因此开发能在细胞内对其检测和调控的工具仍然面临挑战。 L-RNA适配体能够耐受酶的降解并通过结构识别与特定的rG4相互作用，但不好的细胞穿透能力限制了它的后续生物应用。细胞穿透肽（CPP）是一种在生理条件下带正电荷的短肽，能够通过内吞作用直接穿透细胞膜。因此，本文作者理性设计开发了一种L-RNA适配体-CPP偶联物（Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c）如图1所示，他们利用CuAAC点击化学将己炔基修饰的适配体和叠氮标记的细胞穿透肽连接，其中叠氮修饰在赖氨酸的侧链上，并通过不同长度的连接物与不同序列的CPP连接。他们在CPP的N端连接了四甲基罗丹明B进行示踪，通过PAGE胶图验证了偶联的成功。图2. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c与rG4的结合 如图2所示，作者利用微量热泳检测适配体与rG4的结合。通过筛选发现，当CPP序列为八个精氨酸并选择较长的连接物时，适配体与rG4结合的亲和力更高。电泳迁移率变化分析也证实了CPP的修饰不影响Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c与rG4的结合。突变的rG4则无法与之结合，验证了结合的特异性。 图3. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的细胞摄取与结合 如图3所示，将荧光标记的rG4转染进细胞，然后用含Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的介质孵育。Confocal结果显示 Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c能够与rG4在细胞中共定位，且对于突变的rG4荧光信号明显更弱，显示出特异性。图4. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c调节基因表达 如图4所示，本文作者构建了将rG4引入EGFP基因的非翻译区的质粒，并构建了含mCherry基因的质粒作为内参。在Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c的存在下，绿色荧光强度显著降低，说明该适配体确实能够与rG4结合，调控基因的表达，且对突变体的基因表达没有影响。 图5. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c抑制5’非翻译区rG4介导的翻译 如图5所示，为了进一步验证，本文作者在同一质粒中转入内参基因和非翻译区含rG4的基因，发现Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c加入后表达量降低；对于外源添加的适配体来说，带有细胞穿透肽的适配体表现出更好的抑制效果，而利用转染试剂共转染的方式添加，含有细胞穿透肽与不含细胞穿透肽的组别的调控效果则没有明显差别。图6. Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c抑制3’非翻译区rG4介导的翻译 如图6所示，本文作者选取了阿尔兹海默症相关基因，其3’非翻译区含有rG4序列。在加入Tamra_Ahx_R8_L-Apt.4-1c后能观察到表达量的下降，而mRNA水平无显著变化，证实了适配体是在翻译层面而不是转录层面调控基因的表达。 综上所述，本文开发了一种理性设计的L-RNA适配体-多肽偶联物，通过点击反应将修饰了炔基的适配体和修饰了叠氮的细胞穿透肽偶联，能够在避免酶识别降解的同时增加其细胞摄取。该适配体能够被RNA G四联体特异性识别，从而调控多种非翻译区含G四联体序列的基因表达，在疾病的基因治疗方面具有应用前景。DOI: 10.1002/anie.202310798Link: https://doi.org/10.1002/anie.202310798
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