开发用于活细胞中蛋白质化学选择性标记的小分子荧光工具对于评估细胞内氧化还原稳态非常重要。人血清白蛋白（HSA）是人血浆中含量最高的蛋白质，在与氧化应激相关的疾病发展过程中，参与自由基的调节和细胞内氧化还原稳态的维持，导致其氧化形式以及非巯基白蛋白含量增加。因此，细胞内HSA的检测和成像对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义。识别HSA的小分子荧光探针可分为非共价和共价结合模式，共价结合表现出更好的选择性和稳定性，以抵抗小分子和药物的干扰，然而，共价结合对HSA的消耗可能会破坏氧化还原稳态并加剧病理状态。因此，设计开发新的工具，实现能够在氧化应激下成像HSA，同时释放抗氧化药物以抵抗氧化应激，维持氧化还原稳态，对于疾病的诊断和治疗具有重要价值。2021年，课题组基于二甲硫醚乙烯基共轭受体结构和性能开发了茚二酮烯光致发光平台，提出了环化诱导发光和置换诱导发光的发光机制，利用功能分子双位点反应特性和光物理化学变化，构建了系列大分子功能材料和小分子荧光探针，并探索了其应用前景。在聚合物功能材料方面，实现了对软物质材料在化学合成，结构重塑，降解等过程的可视化跟踪和性能调控（J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 3913；J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 51, 21622；ACS Macro Lett. 2021, 10, 1125；ACS Macro Lett. 2021, 10, 901；Polym. Chem. 2022, 13, 922；Aggregate. 2023, 4, e295；ACS Appl. Mater. Interfaces. 2023,15, 19, 22967）；在小分子传感成像方面，实现了小分子挥发性胺的即时检测（Org. Chem. Front. 2023, 10, 1393）和邻二巯基蛋白的位点特异性标记和成像（Anal. Chem. 2023, 95, 32, 11953）。近日，课题组对茚二酮烯共轭受体基元分子结构做了进一步的拓展和功能化衍生（图1），以期提高其光学性能的同时，构建生物大分子传感-标记-成像-治疗多功能一体化分子影像探针，探索将其应用于疾病相关诊疗一体生物应用研究中。相关成果以“A Rationally Designed Prodrug for the Fluorogenic Labeling of Albumin and Theranostic Effects on Drug-Induced Liver Injury”为题发表在Analytical Chemistry上。
图1. （A）共轭受体与双亲核底物的偶联反应及光物理变化。（B）共轭受体分子结构衍生及与药物分子结合构建前药探针。（C）前药分子与HSA反应的光学变化、药物释放及抗氧化效应示意图。
在这项工作中，我们首先设计并合成了一种新型小分子荧光探针TPA-CA，进一步将亲水性药物NAC通过硫醇-硫醇置换制备了荧光前药TPA-NAC（图1B）。TPA-NAC良好的水溶性和生物相容性使其能够以免洗的方式对活人肝细胞癌细胞（HepG2）中的外源性和内源性HSA进行成像。同时，在氧化应激下，NAC触发的上调超氧化物歧化酶（SOD）协同抑制活性氧（ROS），达到抗氧化作用（图1C）。
图2. （A）TPA-CA与生物硫醇反应的光学变化机制。（B）TPA-NAC在内源性生物小分子中选择性荧光识别HSA
通过荧光光谱发现，TPA-CA本身是没有荧光，与HSA反应后发生强烈的荧光增强，而TPA-CA与小分子生物硫醇的反应不能引起荧光信号的变化（图2A）。同样的，前药分子TPA-NAC在水溶液中对HSA也具有高选择性的荧光响应（图2B），通过蛋白质谱和凝胶电泳证明了其与HSA的共价连接，通过高分辨质谱表征，证实了NAC的释放。TPA-NAC具有优越的水溶性和生物相容性，能够很好的应用于成像细胞中内源性和外源性HSA浓度波动。借助商品化的SOD检测试剂盒与活性氧红色荧光探针发现，TPA-NAC在与HSA作用后释放出的NAC能够显著提升细胞中SOD的活性，协同抑制氧化应激中活性氧的上调。
图3. TPA-NAC在药物性肝损伤中的抗氧化效果。
药物性肝损伤（DILI）是指药物或其经过细胞色素P450（CYP450）代谢产生的亲电子基、活性氧自由基等高反应活性代谢产物对肝脏的毒性作用，对患者的发病率和死亡率有显著影响。NAC是FDA唯一批准的用于治疗对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤的药物，也常被用做活性氧清除剂，能够预防APAP毒性反应中氧化应激诱导的肝损伤。为了验证TPA-NAC在药物性肝损伤中的诊疗作用，首先在人正常肝细胞（L-02）中用DHE成像了活性氧（图3A）。TPA-NAC预孵育的细胞内活性氧含量出现了显著性下降（图3B、I）。在L-02细胞内加入APAP构建了药物性肝损伤细胞模型，可以看出与对照组的细胞相比红色荧光显著增强（图3A、C），说明药物性肝损伤过程中伴随着活性氧的上调。而当APAP处理过的细胞经过TPA-NAC孵育后，绿色通道的荧光强度显著降低，说明肝损伤发生时会导致HSA活性的降低（图3D1），红色荧光显著降低也说明活性氧浓度的下调（图3D2）。托卡朋（Tolcapone）和鱼藤酮（Rotenone）诱导的药物性肝损伤中也同样观察到了TPA-NAC的抗氧化作用（图3E-H）。这种荧光变化说明TPA-NAC与HSA结合后释放出的NAC抑制APAP诱导的药物性肝损伤的途径之一是通过下调活性氧来实现的，说明诊疗型荧光前药TPA-NAC在研究HSA和活性氧相关疾病生理和病理机制中具有一定的应用潜力。综上所述，在这项研究中，我们设计了一种水溶性前药探针分子，它能够对HSA进行荧光选择性标记，HSA响应性诊疗一体化荧光探针的开发可以成为实现活细胞传感和成像并平衡氧化还原稳态的有力工具，为推动将HSA相关疾病诊断和治疗应用到临床研究中提供重要参考。上述论文第一作者为博士研究生吴田宏，通讯作者为孙晓龙教授，西安交通大学为第一通讯单位。该研究成果得到了国家自然科学基金项目（21907080、22278330）、西安交通大学青年创新团队（xtr052022012）、大连理工大学精细化工国家重点实验室（KF2301）等的资助。未来，团队将针对生物医学疾病相关标志物的精准可视化高灵敏的检测成像技术开发，进一步拓展茚酮烯功能染料分子体系，通过化学结构衍生、光学性能提升等手段开发功能强大的化学生物学研究工具，在疾病早期诊断、荧光引导手术、生物医学分子影像等领域有所突破。
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