给大家介绍一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，标题是“Immobilized enzyme cascade for targeted glycosylation”，通讯作者是英国帝国理工学院的Karen M. Polizzi教授和Cleo Kontoravdi教授，Karen教授的主要研究方向是体内生物传感器和合成生物学，Cleo教授的主要研究方向是将系统工程原理应用于生物过程，尤其是代谢和糖基化修饰。在本文中，作者提出了一种快速制备固定化酶并用于级联反应制备均一聚糖结构的方法。

Fig.1 靶向糖基化的人工高尔基体反应(SUGAR-TARGET)策略与设计

Fig.2 GnTl和GalT体内生物素化及一步固定化/纯化实验流程

作者首先测试SUGAR-TARGET合成均一游离聚糖的能力，后者能用于表征酶-底物互作或糖结合蛋白如lectin，但想要合成得到高纯度的产物比较困难。为了高效的得到均一游离聚糖，作者在每一步酶反应后进行离心，以分离产物和酶，并使用MALDI-TOF MS监测反应，发现GnTI能将M5以大于95%转化率转化GM5，ManII能将GM5以大于95%转化率转化为GM3，GalT也能将GM3以大于95%转化率转化为GalGM3（图1）。在SUGAR-TARGET体系下每种酶的特异性均接近100%。

Fig.3 固定化酶对mFc的催化级联

紧接着，作者对来自各种糖工程宿主的不同治疗兴趣的糖基化蛋白的适用性进行探索，目的是证明SUGAR-TARGET可以用于修饰一系列细胞来源的物质。作者选用经过糖工程改造的毕赤酵母菌株SuperMan5表达mFc片段，以及HEK293细胞系的GnTI敲除株表达saposin B，以上两种株系均能产生主要为M5的糖结构。通过分泌表达，Ni-NTA纯化得到纯度约97%的mFc，并将蛋白固定在磁珠上进一步缩短了分离时间（图3）。在GnTI-ManII-GalT-SiaT的催化级联中，每步反应均使用MS进行监测。结果显示4步级联反应中每一步转化率均大于95%且糖型均一，证明了SUGAR-TARGET能解决酶的竞争反应并减少糖的非均一性。此外，作者尝试使用SUGAR-TARGET生产saposin B，最终以大于95%的转化率得到了S1GalGM3糖型的saposin B。

Fig.4 使用GalT对IgG进行处理

进一步的，作者分别在3种来源的IgG中验证Gal修饰的影响，即CHO细胞生产的人源糖型IgG（CHO h-IgG），兔血清来源的IgG（r-IgG）和人血清来源的IgG（h-IgG），并用毛细管电泳验证了糖型分布（图4）。3种IgG均在固定化GalT处理后显示出末端Gal高表达，Gal修饰率均提高到大于80%。

Fig.5 固定化GalT处理聚糖

由于GalT修饰涉及多次Gal的修饰过程，作者想将固定化GalT用于研究GalT对底物G0和G0F的特异性，发现由于游离聚糖反应速率较快，必须缩短反应时间到15min左右才有可能捕获中间产物。通过毛细管电泳监测发现，α-1,3臂的单个Gal修饰是限速步，因此认为在进行IgG修饰时，Gal首先在α-1,6臂发生修饰，随后在α-1,3臂发生修饰。由于Gal修饰对糖蛋白类药物有重要意义，因此作者尝试探究固定化GalT的可复用性，具体来说将GalT用于4次独立的反应循环中，中间只经过回收和洗涤。实验发现固定化GalT经过80 h使用后仍能保留70%活性，首次使用时可将末端Gal修饰率从52%提高到97.4%，第四次使用时仍能将末端Gal修饰率提高到84%，因此认为SUGAR-TARGET可以用于生产糖蛋白产品。