分享一篇2023年发表在Chemical Communications上的文章，题目是“A “dual-key-and-lock” ratiometric fluorescent probe with biocompatibility and selectivity for imaging vicinal dithiol proteins”。文章的通讯作者为东北大学分析科学研究中心王建华教授。细胞内常见的邻二硫蛋白（VDPs）含有两个紧邻的半胱氨酸硫醇基团，可以自发地进行可逆的二硫/二硫键转换，比谷胱甘肽（GSH）更具还原性，并在细胞氧化还原平衡中发挥重要作用，同时影响蛋白质折叠、物质吸收和信号传递，并与多种疾病相关。为了应对VDP荧光探针的生物毒性和对小分子硫醇的敏感性问题，研究者们开发了一种具有“双键-锁”机制的比率荧光探针TMR-TPE。该探针由低毒性的3,5-二马来酰亚胺苯甲酸（MBA）作为识别单元，四苯乙烯（TPE）作为信号报告单元，以及四甲基罗丹明（TMR）提供参考荧光信号。在图1A中展示了TMR-TPE的结构。TMR-TPE探针能够有效避免小分子硫醇如GSH的干扰，并在50μM浓度下对细胞几乎无毒，存活率高达98%，成功克服了探针分布和仪器条件的干扰，为研究VDPs在生理和病理中的角色提供了一种高效的工具。
图1： TMR-TPE与VDPs之间的反应示意图及TMR-TPE的荧光开启机制的示意图。
通过研究还原型牛血清白蛋白（rBSA）对TMR-TPE化合物的敏感响应，本文证实了rBSA作为VDPs的经典模型蛋白在研究中的有效性。rBSA含有17对邻近二硫键，两个半胱氨酸-巯基间的平均距离为4埃。实验数据显示，TMR-TPE在没有rBSA时在586 nm处有一个发射峰，而添加rBSA后在471 nm处产生新的发射峰，且随着rBSA浓度的增加，471 nm处的发射峰强度逐渐增强，但586 nm处的发射峰强度变化较小。荧光强度比值（I471/I586）在rBSA浓度为0-1 μM范围内呈现良好的线性关系。通过DFT计算讨论了TPE与马来酰亚胺的PET过程（图2A），并通过SDS-PAGE实验证实了TMR-TPE能够与rBSA共价结合（图2C）。此外，通过使用GndHCl处理后，证实了rBSA能有效抑制TPE的分子内运动（图2D），并且荧光寿命的研究进一步支持了这一结论（图2E）。这些实验结果全面地展示了TMR-TPE对VDPs反应的敏感性和作用机制。
图2：(A) HOMO和LUMO能级的DFT计算结果。 (B) 1,2-(4-氨基苯基)-1,2-二苯乙烷在乙醇/水混合物中的荧光光谱。 (C) SDS-PAGE确认TMR-TPE与VDPs的共价结合。 (D) 加入rBSA并随后用3 M GndHCl处理TMR-TPE的荧光光谱。 (E) TMR-TPE在471 nm处的荧光衰减曲线。
本文研究了TMR-TPE的选择性和生物相容性，并设计了一种“双钥匙-锁”结构以提高选择性和减少小分子硫醇如GSH的假阳性信号。通过对比常规荧光探针，发现在高达10 mM GSH浓度下TMR-TPE信号几乎不被激活，而对照探针会产生明显的假阳性信号（图3B和图3C）。此外，TMR-TPE对其他蛋白质和小分子也显示出了优异的抗干扰能力（图3D）。PAO-EDT作为常见的三价砷识别单元具有严重毒性，而TMR-TPE在50μM浓度下细胞存活率仍超过98%，体现了良好的生物相容性（图3E）。这些结果表明，TMR-TPE是一个高选择性、良好生物相容性且具备足够光稳定性的细胞成像探针。
图3：(A) 参考探针和PAO-EDT。（B）TMR-TPE在存在rBSA或GSH的情况下的荧光强度随时间变化。（C）参考探针在存在rBSA或GSH的情况下的荧光强度随时间变化。（D）TMR-TPE在添加不同物种（（1）空白，（2）精氨酸，（3）苏氨酸，（4）组氨酸，（5）甲硫氨酸，（6）半胱氨酸，（7）同型半胱氨酸，（8）谷胱甘肽，（9）三硫化磷，（10）二硫苏糖醇，（11）脂肪酶，（12）乳酸脱氢酶，（13）溶菌酶，（14）卵清蛋白，（15）BSA，（16）HSA，（17）rBSA）时的荧光强度比值（I471 / I586）。（E）通过MTT测定估计的细胞存活率。
TMR-TPE凭借出色性能被用来在活细胞中特异性成像邻近二硫键蛋白（VDPs）。实验中，HePG2细胞与TMR-TPE共孵育后，绿色和红色荧光均可观察到（图4A）。使用MBA或PAO预处理细胞占据VDPs的邻近二硫位点后，绿光与红光通道的荧光强度比（绿/红）分别下降了38.3%和49.2%，这证明TMR-TPE能够结合到邻近二硫位点，特异性成像活细胞中的VDPs。此外，细胞经100 μM H2O2预处理后，荧光比例降低，说明氧化压力会减少细胞内的VDPs（图4B）。
图4：（A）使用100 μM H2O2，30μM MBA和30 μM PAO处理HepG2细胞30分钟，并用25 μM TMR-TPE染色120分钟的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。（B）细胞中的Fgreen/Fred比率。
药物性肝损伤（DILI）是许多国家急性肝衰竭的主要原因，它与活性氧和炎症密切相关。然而，作为细胞重要的还原库，VDPs在DILI中的作用研究不足。为了探究VDPs在DILI过程中的作用，本文使用对乙酰氨基酚（APAP）刺激HepG2细胞，构建了一个DILI模型。实验表明，1 mM APAP处理后，细胞的荧光比例降至对照组的55.3%，这表明DILI会导致细胞内VDPs显著减少（图5A）。此外，本文评估了GSH、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和葡萄糖醛酸内酯（Glu）这三种常用于DILI治疗的药物的疗效。根据治疗后VDPs的恢复水平，这三种药物的疗效排序为NAC > Glu > GSH（图5B）。
图5：用TMR-TPE 25 μM染色，将HepG2细胞（0.2 mM或1 mM APAP处理12小时）或先用Glu（500 μM），NAC（500 μM）和GSH（500 μM）处理1小时后与APAP（1 mM）一起共同孵育12小时的HepG2细胞的CLSM图像。
综上所述，本文设计并合成了一种“双键和锁”比例荧光探针 TMR-TPE，用于成像可变动性蛋白质(VDPs)。TMR-TPE对于VDPs表现出极强的选择性，通过“双键和锁”的设计，有效地避免了小分子硫醇的干扰。与三价砷探针相比，TMR-TPE还显示出显著改善的生物相容性。利用TMR-TPE成功地在活细胞中对VDPs进行成像，首次发现在药物肝损伤(DILI)期间细胞内的VDP水平显著降低。根据治疗后VDP水平的恢复情况，常用药物治疗DILI的效果为NAC > 谷氨酸 > 谷胱甘肽。改进的探针更适合于VDPs的测量和成像，为相关疾病的早期诊断和治疗研究提供了有效手段。
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