推荐一篇发表在Mater. Horiz杂志上的文章，通讯作者是新加坡国立大学的刘斌教授。细胞膜的损伤会造成多种疾病，如免疫缺陷、糖尿病、肝硬化和肿瘤等。迄今为止，已经报道了几种检测细胞膜损伤的方法，如电子探针显微镜，透射电子显微镜技术，量子点等，但是上述方法存在不能实时成像或者分辨率较低等问题。商业膜染料（DiO、DiD和DiR等）和各种小分子探针也被开发用于追踪细胞形态变化，但大多数都存在光稳定性差、斯托克斯位移小、孵育时间长以及繁琐的洗涤程序以消除背景干扰的问题。为了解决这些问题，作者提出了一种具有灵敏的粘性荧光开启响应的三足酮TPAE2分子转子探针（图1A），用于膜行为的动态监测。在设计过程中，TPAE2的三苯胺骨架可实现分子内旋转，而带正电的吡啶基团，不仅改善了分子转子效应，而且有助于探针与带负电的生物成分（如磷脂和DNA）结合。第三臂配备肉桂酸甲酯单元作为疏水尾部，以增加TPAE2的疏水性。同时，使用相同的过程合成了作为对照的电中性分子（TPAE1）。UV-Vis吸收和发射光谱如图1B所示，虽然TPAE2具有较宽的发射光谱，但其较大的Stokes位移（~230 nm）可避免荧光成像中的串扰现象。微粘度分子转子探针是一种有效的分子设计策略，可实现对环境粘度变化的敏感响应。如图1C和D所示，溶剂混合物（甲醇-不同粘度的甘油（Gly），以研究其分子转子效应。TPAE1和TPAE2的荧光随粘度增大而逐渐增强，分别为12倍和90倍粘度从0.55 cP至945.35 cP。
图1. (A) TPAE1和带正电荷的TPAE2的化学结构。(B) 298k PBS (pH = 7.4)测定TPAE1和TPAE2 (20.0 mM)的紫外-可见吸收和发射光谱。TPAE1 (的荧光发射光谱C)和TPAE2 (D)在含有CH3OH和甘油的混合溶剂中。
为了研究TPAE2与质膜结合的能力，在PBS（pH 7.4）中进行了荧光滴定实验。如图2A所示，在430 nm激发下，仅TPAE2在PBS中仅微弱发射，最大发射在651 nm。然而，与200 mg mL-1的DOPC（1,2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，细胞膜的主要成分之一）相互作用后，荧光强度增加了160倍。此外，发现在存在DOPC或DNA的情况下，TPAE2的荧光寿命比在PBS中（0.72 ns）要长得多（2.61 ns和2.34 ns），使细胞膜和细胞核的荧光寿命成像成为区分分子位置的另一种可能性（图2C）。为了了解TPAE1和TPAE2与细胞膜的相互作用，作者通过分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟来预测两种分子的膜结合方式和保留能力。从最大密度的聚簇中选取具有DOPC双分子层的TPAE1和TPAE2的代表性结构，结果如图2E所示。脂质极性头基团一侧面对高介电性的水，另一侧朝向低介电性的烃核界面。MD结果还表明，TPAE2分子能够通过静电作用和π-π相互作用进入DNA疏水主沟槽中（图2G）。TPAE2与DOPC或dsDNA稳定结合后，荧光强度的增加可归因于TPAE2与DOPC或dsDNA结合，从而限制分子内旋转运动，以最小化的非辐射衰减，激活荧光过程。
图2. TPAE2 (10.0 mM)在PBS溶液(pH = 7.4)中分别用DOPC (A)和DNA (B)滴定后的发射光谱;(C) PBS溶液中加入DOPC和DNA的TPAE2荧光寿命变化;(D) TPAE2 (10.0 mM)在不同极性溶剂，40%甘油，265 cP溶液中的荧光发射;(E) 利用分子动力学(MD)模拟TPAE1和TAPE2的膜结合模式。(F)和(G) TPAE2与DOPC (F)或DNA (G)复合物最稳定的结合模式，其中双链DNA片段为50-CTTTTGCAAAAG-30。(H) TPAE1和TAPE2模型在酯基方向上穿过DOPC双分子层的平均潜在力和保留能力。(I) TPAE1和TAPE2穿过DOPC双分子层的模型。
TPAE1和TPAE2的细胞摄取和分布可以通过荧光显微镜轻松追踪。HeLa细胞与探针（10.0 μM）共培养，如图3A所示，TPAE1在30分钟内渗透到活细胞中，并主要定位在细胞质中。而TPAE2可以在几秒钟内快速照亮细胞膜。此外，即使在24小时后，仍然可以清楚地看到膜染色，没有明显的内化。为了验证它们的定位，处理了TPAE1和TPAE2的HeLa细胞与BODIPY493/503（商业脂滴染料）和DiO进行了共培养。如图3B所示，TPAE1与BODIPY493/503显示出良好的重叠（Pearson相关系数为0.81），而TPAE2与DiO具有0.90的Pearson相关系数。这些结果表明了TPAE1在脂滴中的特异定位和TPAE2在细胞质膜上的特异定位。如图3C所示，经过2-12小时的孵育，大约50-60%的DiO或CMDR（CellMaskTM Deep Red）已经内化到细胞质中，而超过95%的TPAE2仍然保留在细胞膜上。此外，TPAE2在连续照射10分钟后显示出稳定的荧光强度，而在相同条件下，DiO/CMDR的荧光急剧减少到10%和50%，分别（图3D）。TPAE2的超快速和“无需洗涤”的细胞膜染色、长期膜保留、出色的光稳定性和大的Stokes位移也为在细胞代谢过程中跟踪细胞膜行为提供了良好的机会。
图3.（A）TPAE1和TAPE2（10.0 mM）处理的HeLa的实时成像。（B）用TPAE1和BODIPY 493/503（10.0 mM，30分钟），TPAE2和DiO（10.0 mM，30分钟）染色的HeLa细胞的共定位成像。（C）在HeLa细胞中培养不同时间后，TPAE2和商业细胞膜染料DiO和CMDR（CellMaskTM深红色）的相对荧光分布统计;（D）连续照射10分钟后，TPAE2（10.0 mM）与DiO和CMDR（10.0 mM）的光稳定性。
由于凋亡是常见的一种程序性细胞死亡模式，它涉及到特征性的膜形态学变化。因此，已有研究报道了关于凋亡过程中细胞形态追踪的工作。因此，可以利用凋亡模型验证这种膜-核转移策略在原位监测膜损伤方面的实用性。本研究通过对凋亡细胞进行形态学变化和质膜渗透性改变的调查。将HeLa细胞与顺铂（25 μM，孵育12小时）共同染色，以诱导细胞凋亡，然后使用Annexin V-FITC/PI和TPAE2进行共染色。如图4A所示，随着孵育时间的增加，细胞膜逐渐变得不规则且波浪状，同时出现出芽和肿胀。同时，TPAE2对质膜的染色与Annexin V-FITC发出的荧光叠加良好，清晰地显示了早期凋亡细胞的膜形态。更有趣的是，随着孵育时间的增加，随着细胞凋亡的发生，TPAE2发出的红色荧光逐渐增强，尤其是在一些严重凋亡的细胞中。当细胞进入凋亡的后期，根据PI核染色显示，TPAE2也在核内可见（图4B）。值得一提的是，在已经被TPAE2染色的凋亡细胞中，通过剩余定位在质膜上的TPAE2仍然可以看到质膜，因此，单个分子可以同时监测质膜和核的形态变化，从而实现对整个凋亡过程的连续监测。这种能够简单而持续地监测凋亡的能力对于生物医学研究，如药物筛选，具有很高的需求。
图4. 顺铂（25.0 mM）和处理细胞在不同凋亡阶段的放大图像。与TPAE2（10.0 mM）和膜联蛋白V-FITC（A）和PI（B）共同染色的时间不同。
总之，所开发的TPAE2可以在与DNA和溶液中的膜DOPC的主要成分相互作用时选择性地点亮。它可以实现超快和“免洗”的细胞膜染色，并具有长期的膜保留能力，出色的光稳定性和大的斯托克斯位移，这为跟踪不同条件下的细胞膜行为提供了很好的机会。一旦膜丧失其完整性并变得更具渗透性，在经历水肿的细胞中就会观察到TPAE2的膜-核转移和核增白，可以用作膜渗透性改变的指标。使用TPAE2对细胞膜和细胞核进行级联成像，可以在整个细胞凋亡过程中实时，原位监测膜损伤。在白光照射后，TPAE2还可以通过光敏作用破坏细胞膜并迅速染色细胞核，以实时报告细胞膜破坏情况。能够同时跟踪质膜的形态变化和通透性变化以及不同细胞中的核形态的能力，使得TPAE2具有评估细胞状态和疾病诊断的应用潜力。这种膜到核的移位策略为光敏剂材料的设计开辟了一条新途径。
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