分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition的文章，Azobenzene-based Linker Strategy for Selective Activation of Antibody-Drug Conjugates，基于偶氮苯的连接策略选择性激活抗体-药物偶联物。

抗体药物偶联物 (ADC) 是由化学接头连接的细胞毒性有效负载和单克隆抗体，正在逐渐彻底改变癌症治疗。目前已有15个ADC获批临床，超过100个ADC处于不同阶段的临床试验。然而，由于传统连接器设计的缺陷，ADC的发展受到致命的脱靶毒性的严重阻碍。现有的连接子，无论是可裂解的还是不可裂解的，都旨在ADC内化到靶细胞中后释放剧毒的有效负载或有效负载衍生物。不幸的是，临床研究表明，<1% 的 ADC 会在肿瘤细胞中积累。其余 >99% 的 ADC 脱离肿瘤，并通过多种机制（例如抗原介导或Fc受体介导的内吞作用）非特异性分布在健康组织细胞中。因此，必须改进接头设计策略，以避免在 ADC 脱靶时对健康组织产生不良副作用。

缺氧是实体瘤微环境的独特特征，为实现肿瘤特异性接头裂解提供了机会。在本研究中，研究人员通过应用偶氮还原酶进行接头设计，开发了第二代低氧敏感性ADC。偶氮还原酶在大多数肿瘤细胞系中高表达。更重要的是，偶氮还原酶介导的还原过程受到氧浓度的强烈影响。在缺氧条件下，偶氮化合物的 N=N 键会发生不可逆的还原破坏。通过引入缺氧激活的偶氮苯，构建依赖于偶氮还原酶的连接体，从而在肿瘤细胞中实现了精确的氧控制细胞毒性（图1）。当暴露于缺氧的肿瘤微环境（O2<1%）时，偶氮苯可以被偶氮还原酶不可逆地裂解，顺利释放有效负载MMAE，从而杀死肿瘤细胞。

图1

为了合理设计一种能够有效掩盖 MMAE 毒性的偶氮苯连接体，研究人员研究了 MMAE 与微管蛋白 (PDB 5iyz) 复合的晶体结构。如图2所示，微管蛋白中MMAE的结合口袋呈现出窄而长的结构，口袋入口宽度为4.6Å。该口袋由氨基酸ASP179、PHE351、ASN329、PRO222、GLY225、TRY224和GLN15包围。采用MMAE和MMAF作为有效负载的不可切割连接器，采用柔性链结构，允许MMAF/MMAE深入进入口袋。在本研究中，研究人员利用偶氮苯的刚性平面结构（宽度 5.6 Å）来取代新型偶氮苯连接体中的自消除对氨基苯甲醇 (PAB) 部分。引入不同的PEG基团来研究它们对ADC水溶性和活性的影响。在常氧条件下，偶氮苯连接体保持不可裂解，导致偶氮苯滞留在口袋入口处。这会阻止 MMAE 进入结合口袋（距离口袋底部7.2Å），有效掩盖MMAE的毒性（switched off）。然而，当暴露于缺氧的肿瘤微环境时，偶氮还原酶会裂解偶氮苯，促进 MMAE 的顺利释放，从而诱导肿瘤细胞死亡（switched on）。为了快速验证研究人员的设计，将基于偶氮苯的接头-MMAE与广泛研究的抗HER2抗体赫赛汀缀合，合成含有偶氮苯接头的ADC（简称AZO-ADC）。

图2

成功合成五种AZO-ADC后，研究人员的目标是选择具有最佳掩蔽效果的ADC。首先，研究人员比较了常氧和低氧条件下AZO-ADC对肿瘤细胞的体外细胞毒性（图3a）。为了准确评估新型偶氮苯连接体的掩蔽特性，使用HER2+赫赛汀抗性细胞系（SKOV3和BT474-HDR）以避免赫赛汀抑制活性的混淆效应。蛋白质印迹（WB）结果显示，偶氮还原酶在肿瘤细胞（包括SKOV3、BT474、NCI-N87、SKBR3和JIMT-1细胞）中高表达，但在正常细胞（如293T和NIH3T3细胞）中不高表达（图3b）。肿瘤细胞中高表达的偶氮还原酶功能良好，经典偶氮还原酶探针BioTracker 520具有强烈的绿色荧光信号（图3c）。

图3

接下来，研究人员检查了肿瘤和健康细胞中接头介导的细胞毒性作用。有趣的是，具有PEG2偶氮苯基接头的AZO-ADC-2在SKOV3和BT474-HDR细胞中表现出显着的掩蔽效应，在常氧（20%O2）下细胞毒性降低了500倍以上（图3d）。然而，暴露于缺氧后，AZO-ADC-2的细胞毒性完全恢复，选择性指数（SI）增加到500以上。带有PEG0偶氮苯基连接体的AZO-ADC-0的SI显着降低，可能是由于过度聚集由偶氮苯的疏水性引起（图3e-f）。具有PEG4偶氮苯基连接体的AZO-ADC-4也表现出令人满意的掩蔽效果（SI>100，图3e-f，）。然而，当PEG链进一步延伸时，如AZO-ADC-6和AZO-ADC-8中分别含有PEG6和PEG8偶氮苯基连接体，SI显着降低（图3e-f）。这些结果表明，PEG链的长度可能会影响偶氮苯基连接体的掩蔽效果。研究人员认为长链PEG会在空间中缠绕，阻碍偶氮还原酶还原接头中的偶氮苯。因此，含有PEG2偶氮苯基连接体的AZO-ADC-2被选为SI最高的ADC进行进一步研究。

接下来，研究人员评估 AZOADC-2是否符合合格ADC的标准，包括适当的DAR、血浆中的高稳定性、有效的药物释放、高抗原亲和力和足够的内吞速率。首先，HIC分析将缀合物解析为几个主峰，对应于每个抗体0、2、4和8个药物分子（图4a），AZO-ADC-2的平均DAR为4.1，这符合合格ADC的DAR标准。总的来说，DAR 4的ADC由于其足够的亲水性和良好的体内药代动力学特性，是临床和市场上最常见的ADC。UPLC-Q-TOF-MS分析表明，AZO-ADC-2每个抗体含有4.1个药物分子（图4c）。此外，AZOADC-2在人血浆中7天内显示总MMAE有效负载的释放量<1%（图4d），表明血浆稳定性良好。当存在0.4 mg/mL、0.1 mg/mL 和 0.05 mg/mL 的偶氮还原酶时，缺氧24小时时分别释放 100%、74.3% 和 27.49% 的MMAE有效负载（图4e）。相比之下，在正常氧饱和度、偶氮还原酶浓度为 0.1 mg/mL 的情况下，24 小时后仅释放 14.99% 的 MMAE 有效负载（图 4e）。这些结果表明，缺氧会以偶氮还原酶和氧气依赖性方式诱导 MMAE 的释放。常见生理离子的存在不会导致游离 MMAE 的显着释放（图4f），验证了接头的偶氮还原酶特异性。

图4

AZO-ADC-2 和赫赛汀对 HER2 抗原的结合亲和力相当，EC50 值分别为 0.14 μg/mL 和 0.042 μg/mL（图 4h）。使用激光扫描共聚焦显微镜评估了 SKOV3 细胞中 AZO-ADC-2 的内化和运输。确认4°C下AZO-ADC-2与细胞表面结合后，将细胞在37°C下孵育以进行内化。显微镜分析表明，细胞内抗体信号与溶酶体信号共定位（Pearson相关系数=0.87），表明 AZO-ADC-2 被内化并转运至溶酶体（图4j）。AZO-ADC-2内化率与传统的基于二肽接头的 VC-ADC 内化率相似，24小时时的值为 41.7% vs. 44.70%，并且显着高于赫赛汀内化率（24 小时时的值为 41.7% vs. 44.70%）。24 小时时为 31.1%（图 4k）。因此，AZO-ADC-2满足合格ADC的所有标准，在与肿瘤微环境相似的氧气条件下表现出良好的血浆稳定性和高效的药物释放。

图5

研究人员进一步研究了基于偶氮苯的连接体是否可以赋予 AZO-ADC-2 额外的优势。如上所述，AZO-ADC-2 可以掩盖健康组织中的毒性（常氧，20% O2），但在肿瘤中保留高毒性（缺氧，0.1% O2）。因此，研究人员假设 AZO-ADC-2 通过抗原和缺氧选择性的结合发挥其抗肿瘤活性。首先，评估了 AZO-ADC-2 对各种 HER2+ 和 HER2- 赫赛汀敏感细胞系的抗体靶向（抗原选择性）效果。AZO ADC-2 在缺氧条件下有效抑制 HER2+ 细胞系 NCIN87、BT-474 和 SKBR3 细胞的生长，EC50 值分别为 0.069、0.026 和 0.016 nM（图 5a）。相反，赫赛汀对这些细胞系的抑制活性比 AZO-ADC-2 弱。此外，AZO-ADC-2 对 HER2− 细胞系表现出低细胞毒性（EC50 >100 nM，图 5a）。这些数据证实了 AZO-ADC-2 的抗体靶向（抗原选择性）能力。

为了比较AZOADC-2和VC-ADC的潜在脱靶毒性，在正常细胞中测试了体外细胞毒性。AZO-ADC-2 在 NIH3T3 和 293T 细胞中表现出弱抑制活性，在最高测试浓度 (666 nM) 下的最大抑制<50%（图 5d），而 VCADC 表现出强烈的脱靶毒性（EC50 <10 nM），最大抑制>90%，（图 5d)。据研究人员所知，AZO-ADC-2是第一个在肿瘤和健康组织之间实现SI值数百的ADC，表明缺氧激活的基于偶氮苯的接头设计策略的独特优势。

图6

在证明了 AZO-ADC-2 的选择性细胞毒性和作用机制后，研究人员探索了其体内抗肿瘤潜力。为此，首先在经典的 HER2high NCIN87 异种移植模型和难治性乳腺癌模型 HER2low JIMT-1 异种移植模型中确定了 AZO-ADC2 单药治疗的抗肿瘤作用（图 6a） 。在 HER2high NCI-N87 异种移植模型中，赫赛汀、AZOADC-2 和 VC-ADC 每周一次，剂量为 5 或 10 mg/kg，连续四周。与对照组相比，AZO-ADC-2（5 mg/kg）治疗组显示出显着且持续的肿瘤生长抑制，抑制率为90.97%（图6b）。这一结果表明，AZO-ADC-2 具有与传统 VC-ADC 几乎相同的抗肿瘤活性（图 6b）。此外，10 mg/kg的AZO-ADC-2治疗完全抑制了异种移植肿瘤的生长（图6c-d），进一步证实了AZO-ADC-2在体内具有令人满意的抗肿瘤功效。

本文作者：TZM

责任编辑：TZM

DOI: 10.1002/anie.202310318

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202310318