分享一篇发表在Nat. Chem. Biol上的文章，文章的题目是“Tracking endogenous proteins based on RNA editing-mediated genetic code expansion”，通讯作者是来自北京大学的刘涛特聘研究员，其研究方向是蛋白工程和基因密码子扩展技术的研发及应用。内源蛋白的选择性标记和可视化是检测细胞内目标蛋白质动力学和互作的重要工具，荧光标记极大促进了对在体蛋白质定位、结构和功能的研究，其中荧光融合蛋白技术被广泛用于标记靶蛋白，但需要过表达编码蛋白的开放阅读框，且N端或C端的蛋白质融合可能会干扰蛋白的表达、折叠、定位和功能，而内源蛋白质的表达受到环境的严格控制。虽然抗体、小分子和多种化学探针为直接标记内源蛋白提供了工具，但是为特定蛋白开发高特异探针仍十分有挑战。此外抗体不具有细胞渗透性，妨碍了其在活细胞成像中的应用；基因组编辑技术使得原位敲入荧光蛋白或特定标签成为可能，但在DNA水平上突变可能会造成不可逆的影响，且一些蛋白对应的基因末端的原间隔器邻近基序序列不可用，因此作者希望开发其他的技术用于内源蛋白质活体成像。基于此，作者通过遗传密码子拓展技术，利用RNA编辑引入无义密码子，随后通过正交的氨酰tRNA合成酶和tRNA，位点特异引入非天然氨基酸，利用荧光氨基酸或氨基酸侧链的官能团进行生物正交反应携带荧光标记，用于活细胞成像。由此，作者可以在不改变基因组DNA序列下，为研究内源蛋白的功能和定位提供强大的工具，将此技术命名为RENAPT。为了引入无义密码子，作者采用C-U碱基编辑器进行评估，发现编辑效率有所不同，其中CAG是引入非天然氨基酸的最佳密码子。为了提高RNA编辑效率，作者破坏无义介导的mRNA衰变过程，发现抑制该途径后编辑效率提升2至3倍。此外，通过分选转染细胞可以更准确测定编辑效率。随后作者将内源ATP5A mRNA中编码Q439的CAG转化为无义密码子UAG，通过抗体纯化蛋白后，用串联质谱分析，证实了非天然氨基酸被引入至编码ATP5A蛋白的Q439位点。为了评估引入效率，作者选取了荧光氨基酸标记内源的葡萄糖调节蛋白94（GRP94），发现不同位点的标记效率可能受到编辑效率的影响。为了测试此技术是否可以帮助监测细胞内源蛋白质的精确亚细胞定位，作者用RENAPT技术引入荧光氨基酸后，发现其与相应的亚细胞器标记蛋白共定位，证明了方法的有效可靠。为了促进此技术在活细胞中的长期动态可视化应用，作者利用点击化学，选取了反式环烯赖氨酸TCOK和四嗪衍生的荧光染料SiR-Tz，其中SiR-Tz对远红波长有响应，与TCOK反应后可以与超分辨显微镜兼容，进一步证明了RENAPT技术标记内源蛋白的高特异性。随后为了证明技术的实用性，作者测试了是否可以用两个不同的无义密码子同时标记两个内源性蛋白，以跟踪其定位。作者选取了具有相同氨基酸序列的H3f3a和H3f3b，并证明可以通过此种技术进行双色荧光标记。此后，作者选择了两种亚细胞定位的内源蛋白，也观测到内源蛋白和对应的亚细胞器定位蛋白的共定位良好，由此验证了此技术可以在活细胞中实现高效、双重标记内源性蛋白。后续，作者通过点击化学介导的SiR-Tz染料，证明了此技术可以实现内源蛋白的实时和动态标记，与超分辨成像显微镜兼容。为了实时成像海马神经元的内源蛋白，作者采用此技术对五种蛋白进行了荧光标记，分别是钙离子通道、代谢性谷氨酸受体、谷氨酸受体通道亚基、钾电压门控通道亚家族和毒碱乙酰胆碱受体，在含有靶向gRNA编辑系统的细胞中可以观测到荧光信号，证明了内源性离子通道和神经元特异性蛋白可以在初级神经元中实时标记。总之，RENAPT提供了一个有前景的平台，具有广泛的适用性，可标记活细胞中的内源性蛋白，以研究其定位和功能。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-023-01533-w文章引用：DOI：10.1038/s41589-023-01533-w
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