Nat. Commun.||:两亲性偶氮苯对细胞膜面积的快速和可逆光学切换

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介绍一篇2023年发表在nature communication上的文章,文章的题目是:Rapid and reversible optical switching of cell membrane area by an amphiphilic azobenzene德国明斯特大学软纳米科学中心的Bart Jan Ravoo教授团队。

脂质双分子层膜是细胞结构的核心部分,其分子组织和总面积受到胞吞作用和胞吐作用、网格蛋白包被的凹坑和小泡等过程的严格调节。膜面积直接影响膜张力,面积体积比的变化对细胞形状至关重要。反过来,由于缺乏控制细胞膜面积的实验工具,许多与细胞形状、膜张力稳态和局部膜面积有关的重要问题有待解决。
首先作者选取了红细胞作为靶细胞,因为形状可控,且表面体积比的微小变化也会引发剧烈的形状变化。操纵细胞的几何形状方法,一是用特定的两亲性药物插入到磷脂双分子层的外或内半小泡中,并引起干扰,分别导致棘刺细胞或气孔细胞的形成,导致形态变化。另一种是改变周围介质的强直性(有效渗透压梯度)。这两种方法是可逆的,但操作缓慢(渗透需要几十秒),且当需要直接观察细胞时,改变周围介质更为复杂。
因而作者提出通过光照以快速、可逆的方式调节红细胞和其他真核细胞(如成肌细胞和癌细胞)的膜面积的方法。偶氮苯可以通过不同波长的光照实现快速且高度可逆的光异构化,由此将偶氮苯引入膜中即可通过光异构化实现活细胞快速可逆的表面积变化。
作者合成了一种两亲性阴离子偶氮苯衍生物,并对其光物理性质进行了分析。图1a显示了偶氮SO3H的分子结构以及偶氮SO3H (DMEM中初始态和两种光稳定态(PSS)的紫外/可见吸收光谱。为了证明高效的光异构化过程,测量了多个开关周期。图1b显示了10个开关周期。分别用紫外LED365nm)和蓝色LED465nm)交替照射10s,通过347nm处吸光度峰值处测定了光异构化的完成程度。可以看出偶氮苯SO3H没有出现疲劳现象,并表现出良好的光异构化行为。

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1 Azo-SO3的可逆光致异构化。

表面张力测量证实了偶氮SO3H的两亲性,发现光异构化对偶氮SO3H的疏水性有很大影响,z -异构体比e -异构体更容易溶于水相。作者测试了细胞是否能从溶液中捕获并部分去除偶氮SO3H。在可见光照射后,通过吸收光谱测量上清液中光开关的浓度,发现更多的z -异构体仍在水相中。这些实验有力地证明了疏水的e -异构体确实比亲水的z -异构体更倾向于嵌入红细胞的质膜。
为了观察偶氮SO3H对红细胞膜和细胞整体形态的影响,将红细胞小心地加入到偶氮SO3HDMEM溶液中(c = 1.0 mM,即低于临界胶束浓度)最初,几乎所有的细胞都呈圆齿状(见图2a)。这是因为光开关处于热力学静止状态(e -异构体),并立即插入红细胞的质膜,从而增加了膜面积。观察几个小时,未发现这些细胞的形态有任何变化。然而,在紫外光(365 nm)照射下,观察到非常快速和明显的形状变化。红细胞在不到2s的时间内转变为不规则轮廓的盘状细胞形状(见图2b, c)。偶氮SO3He -异构体插入到红细胞质膜的外半小叶中,导致膜面积增加,从而改变红细胞(棘细胞)的表面积与体积比。一旦分子开关被光异构化为z型异构体,与脂质双分子层结合的偶氮SO3H显著减少(~40%)。光异构回e -异构体(490 nm),偶氮SO3H重新结合到红细胞表面,因此可以再次观察到棘细胞(2c)。为了量化可见变化,作者计算了盘状细胞和棘细胞形式的自由漂浮红细胞图像的像素值的标准差,作为红细胞图像结构均匀性的衡量标准。观察到两个阶段之间的显著差异(见图2e)

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自由漂浮的红细胞的显微镜图像。

为量化光开关对红细胞力学的影响,作者对红细胞进行了微移液管抽吸。图3a显示部分抽吸的红细胞。红色虚线表示舌在初始状态下的位置,如图3a顶部面板所示。偶氮SO3He -异构体嵌入红细胞质膜中,增加外半小体的膜面积。在紫外线照射下,偶氮SO3He -异构体倾向于离开双分子层,与初始状态相比,表面积减小。图3b中描述了多次周期实验中舌头在移液器内随时间的跟踪位置。显示了响应偶氮SO3H光异构的细胞膜在微移液管内外的快速和可逆的运动。

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分析具有约低施加张力的抽吸红细胞。

在图3c中,10个周期的时间相关运动绘制为红点,黑色曲线分别是紫外线和可见光的指数拟合。在紫外线(tUV)照射后,舌立即显示出大而快速的移液器运动。tUV = 240±70 ms开关可以达到平台。可见光开关的弛豫时间要慢两倍,为tvis = 490±110 ms(3e)。很可能快速的光异构化(~10−12 s)本身并不是决定速率的步骤。因此,膜伸展和膜收缩要么发生在不同的时间尺度上,要么偶氮-SO3H从质膜上脱离的速度快于插入的速度。可见光照射时,膜表现出更强的波动,然后延伸到移液器中。相反,当紫外线照射时,膜波动没有增加。图3还显示了微移液器实验统计分析的总结结果。红细胞平均表面积变化如图3d所示。平均绝对面积变化为2.9±1.2µm2,相对表面积变化为2.1±0.9%
作者通过微移管实验研究光异构化速率是否改变弛化时间,在多次循环中逐渐增加可见光照射强度,同时保持紫外线照射不变,以始终回到PSSE→Z。此外,还进行了紫外光强度增加而可见光强度保持不变的反向实验。图4可以看出,在低可见光强度下,tvis较高,并随着可见光强度的增加而降低。此外,在一定的可见光强度下,弛豫时间达到一个与恒定可见光强度下的循环实验相似的tvis的高原值(图4a)。随着紫外线强度的增加,也可以观察到相同的趋势(图4b)。表明在较低的照射强度下,完全光异构化的速度会减慢,因此弛豫时间较长。但在一定强度下,弛豫时间不再因光异构化速度加快而加快,其他效应也限制了弛豫速率。高光照强度下tUVtvis两个时间之间的速率差异可能是由于偶氮-SO3H从周围的水扩散到膜中和从膜中扩散出来之间的不对称性造成的。

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吸出的红细胞的弛豫时间取决于光强度。

对自由浮动红细胞的分析也显示了弛豫时间对辐照强度的依赖性,可见开关也比紫外开关慢。因此,弛豫时间的差异是由偶氮SO3H从质膜上插入或脱离引起的。
根据偶氮苯(Azo-SO3H)的光异构化,它要么大部分自由溶解在介质中(z型异构体),要么嵌入到红细胞的质膜中(e型异构体)。紫外光(365 nm, E-to-Z)或可见光(490 nm, Z-to-E)可以快速可逆地触发光异构化。光异构化和随后的膜嵌入或膜外扩散引起红细胞快速而强烈的反应。偶氮SO3H亲水性较强的z -异构体对细胞膜亲和力较弱,红细胞呈盘状;疏水性较强的e-异构体插入膜内,红细胞呈尖刺细胞状。这两种形态可以在光照射下以高度可逆和快速的方式相互转化。如图5

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红细胞的光响应形状转变。

本文提出的光可逆膜插层机理得到了分子动力学模拟的支持。在模拟开始时,偶氮SO3He-z -异构体(6a)位于溶液中,而在模拟过程中它们被膜吸收。由于高亲和力,它们在模拟的剩余时间内留在膜中(6a)。有趣的是,分子在膜中比在溶液中拉伸得更大(6a)。此外,分子的偶氮苯单元始终保持在同一个小叶中,并指向膜的中心(6a, b)

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 6 Azo-SO3脂质膜的分子动力学模拟。

综上所述,作者合成了一种两亲性偶氮苯分子光开关(Azo-SO3H)。在基础培养基中,它表现出典型的偶氮苯光异构反应。分配系数(正辛醇/DMEM)表明,z -异构体处于疏水相的概率比细胞磷脂双分子层低约40%。红细胞作为活体模型系统的体外研究结果表明,z -异构体在质膜上的掺入确实减少了约40%。红细胞的显微镜研究阐明了这些发现,并显示出从盘状细胞到棘细胞的光响应性和可逆的形状变化。微管实验进一步深入了解光诱导红细胞形状变化的动力学。在光照射周期中观察到2.1%的可逆相对表面积变化。在实验条件下,发现光响应红细胞能够在W=6700 kBT的吸入压力下工作。此外,在三种不同的细胞系中的膜扩张和收缩,表明偶氮-SO3H确实可以用于各种活细胞的光调节。实验证实偶氮SO3He-异构体插入到质膜中,从而增加了膜的总表面积,而z-异构体被排除在膜外,导致膜的表面积减少。简而言之,通过简单的光照射,提出了一种高度可访问和直接的方案,用于快速和可逆地操纵活细胞的表面积。该工具可以测试膜面积在基本细胞生物学过程中的重要性。同时由于光可以应用于高度局部化和精确定时,现在可以精确地操纵膜面积,从而精确地控制膜张力,进而得以深入研究生物膜行为。
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