分享一篇近期发表在JACS Au上的文章，题目为Construction of an Enzyme Cascade Based on the Accurate Adjacent Arrangement of Coupled Enzymes Using a Triblock PolyA DNA Probe。文章的通讯作者是上海计量测试技术研究院的刘刚、闻艳丽和上海大学的宋世平。
细胞内酶的级联反应在生命活动中起着至关重要的作用。受自然界酶级联反应的高特异性和高效率的启发，人们进行了广泛的研究以在人工系统中模仿其功能。例如，酶级联已成功应用于开发省时且高效的药物合成技术，以及高度特异和敏感的生物传感器。仿生酶级联的反应效率高度依赖于多个酶在受限人工界面上的空间组织。研究人员发展了多种策略以解决酶级联生物传感器组装中的两个主要挑战：实现酶偶对在异质界面上的完美1:1相邻分布，这直接影响反应效率；精确调控每对酶之间的距离，以在临界耦合长度内促进底物的有效传输。
如图1，作者使用一个中间为polyA，两端为捕获探针的三段式ssDNA（probe-polyA-probe，PAP）作为葡萄糖氧化酶GOx和辣根过氧化物酶HRP的linker，其中polyA部分能够通过与金的亲和力在金片电极表面组装，探针部分则通过碱基互补配对捕获两种反义ssDNA修饰的酶；通过调节polyA片段的长度，可以准确方便地调整GOx与HRP的间距。该策略解决了两种酶精确1:1分布和控制二者间距在临界耦合长度之内这两大问题。体系中的葡萄糖被GOx催化氧化，生成过氧化氢，过氧化氢又通过HRP催化氧化体系中的TMB底物，TMB作为电子转移介质产生可检测的电信号。作者使用循环伏安法和安培法研究了酶级联反应的电化学行为，循环伏安曲线显示在加入10 mM葡萄糖底物后施加300 mV电压，电流峰值明显增加；固定电压下安培-时间曲线显示在10 mM底物存在时电流比空白电流高100倍，这说明了该酶级联反应具有低背景和高信噪比。 作者首先使用SPDP（含NHS与吡啶基二硫基的linker）将目标酶上的伯胺与修饰了巯基的ssDNA片段偶联起来，并将准备好的三段式PAP负载到金电极表面。将负载后的电极插入两种酶的混合溶液中孵育2小时，使得PAP的探针部分与酶上携带的反义链配对，该生物传感器即制备完成。TEM照片（图2a）显示，PAP能通过同样的策略将两个直径6 nm的小金纳米颗粒（尺寸与酶相似）成对连接起来。作者通过AFM测定了一对小金纳米颗粒间的距离，随着polyA长度的增加，间距增大，极值为20 nm左右。 接下来，作者探究了电极上的酶级联反应，与酶级联电极相比，未负载酶的空白电极或者单酶电极均无可检测的电流信号，且电流信号与polyA长度有密切关系，即与酶偶对的空间距离有密切关系，polyA长度为50 nt时电流强度最高（图3）。 作者优化了例如孵育浓度等制备条件，并且使用硫醇屏蔽了金电极的非特异性吸附，最终获得了优异的传感性能，与现有其他检测方法相比，该生物传感器有更低的检出限和更宽的线性检测范围（图4）。 综上所述，这篇论文提出了一种基于三段式ssDNA（PAP）的酶级联系统，并验证性地开发了一种葡萄糖传感器。通过调节polyA片段的长度，研究者们能够精确控制酶之间的分子距离，从而提高酶级联反应的效率，该传感器在人血清样本中对葡萄糖具有优异的检测能力，具有低检测限和高灵敏度。此外，他们还构建了一个以直链淀粉为底物的三酶级联反应来展示该系统的可扩展性（图5）。这项研究为开发易于操作、高效且多功能的酶级联系统提供了一个有前景的平台。DOI: 10.1021/jacsau.3c00673Link: https://doi.org/10.1021/jacsau.3c00673
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