四嗪生物正交开启型探针已成为活细胞和活体成像的重要工具。这类探针的荧光信号仅由生物正交反应产生，可将背景信号最小化，提高成像信噪比。但目前绝大部分的四嗪探针仅对逆电子需求的Diels−Alder (IEDDA)反应表现出优异的荧光开启能力；而对于四嗪和异腈间的[4+1]生物正交环加成反应，其荧光调控能力大幅降低（图1）。因此，针对四嗪[4+1]生物正交反应开发新的探针设计策略可为活细胞成像提供新的化学生物学工具。更重要的是，利用四嗪[4+1]反应与其他生物正交反应的相互正交性还可实现对单个细胞内多个亚细胞靶标的同时成像。

近日，四川大学华西医院吴昊星课题组在前期开发的Huaxi-Fluors荧光骨架基础上（Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 2393.），成功构建了一系列针对四嗪[4+1]生物正交反应的荧光探针。该系列探针与苯乙基异腈或者叔丁基异腈反应后，在水溶液和乙醇中都表现出了高量子产率、高开启倍数（up to 3184-fold）、可调节的发射波长（473‒659 nm）等一系列的优异性质（图 2）。新加坡科技与设计大学刘晓刚团队通过“暗态-亮态”理论解释了探针荧光开启机制。反应前的四嗪探针处于“暗态”，基本没有荧光；与不同的异腈反应后得到的吡唑产物融入到所设计的分子共轭骨架中，使整个分子处于“亮态”，荧光开启。与之前的四嗪荧光探针设计策略相比，本文中荧光探针原位生成策略，通过合理利用生物正交吡唑产物与所处共轭结构的关系，实现对荧光性质的高效、可控调节，解决了以往策略吡唑产物对荧光仍然抑制荧光信号，从而降低成像信噪比的难题。

作者首先成功地利用该探针实现了多种亚细胞结构：细胞核、溶酶体和内质网的活细胞免洗成像。在此基础上，作者通过对四嗪取代基结构的调控，使特定的四嗪分子在异腈和亲二烯体共同存在时，只特异性地发生四嗪[4+1]环加成反应，而不发生IEDDA反应（图 3）。实现了所开发荧光探针与四嗪IEDDA反应、环张力促进的生物正交反应（SPAAC）、铜催化的点击反应之间的相互正交。作者利用这些相互正交的生物正交工具，在溶液、大分子和活细胞多个层面证明标记的可行性和正交性。最后，作者利用多种生物正交探针工具，在同一活细胞中对不同的亚细胞结构实现了细胞器特异性的多重标记和免洗成像。

综上所述，该研究利用荧光团原位生成策略，开发了一系列用于四嗪-异腈生物正交化学的高开启荧光探针。量子化学计算通过暗态调节的原理，进一步阐明了生物正交吡唑产物在调节荧光开启中的作用。这些探针表现出良好的生物相容性和与其他生物正交化学物质的正交性，非常适合用于活细胞内多个靶点的动态可视化，期望该研究中呈现的设计策略和所开发的生物正交工具能够在多重标记和检测工作得到广泛应用。