分享的是一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，标题是“O-GlcNAc forces an α-synuclein amyloid strain with notably diminished seeding and pathology”。本文的通讯作者是来自美国南加利福尼亚大学化学系的Matthew R. Pratt教授，他的研究重点是开发生物正交化学报告基因和合成蛋白，以研究翻译后修饰的作用，特别是细胞内的O-GlcNAc 糖基化修饰。本文中，作者研究了O-GlcNAc修饰对帕金森病(PD）、阿尔兹海默病(AD）等神经退行性疾病(NDD)中一种非常重要的蛋白——α-突触核蛋白的影响，研究结果证实O-GlcNAc 可以迫使 α-突触核蛋白淀粉样蛋白菌株的形成，从而降低其在神经元和体内的致病性，这对相关疾病的研究具有十分重要意义。

图1 O-GlcNAc 修饰的α-syn

作者主要研究的是α-syn的S87处的O-GlcNAc修饰，称为α-syn(gS87)。作者首先验证了α-syn(gS87)可形成具有不同结构的淀粉样蛋白聚集体。研究者分别将α-syn或α-syn (gS87)置于成熟且经过验证的α-syn纤维化条件下。然后通过沉降和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了聚集反应（图2b）。这些数据证实 α-syn(gS87) 聚集，但程度较小，这与之前的发现一致，即 O-GlcNAc 抑制 α-syn 聚集的成核步骤。然后，作者使用透射电子显微镜(TEM)证实α-syn和α-syn(gS87)正在形成淀粉样原纤维（图2d）。为了间接探究结构差异，对α-syn和α-syn(gS87) 进行了蛋白酶K (PK)消化。简而言之，PK 很容易将单体α-syn消化成非常小的肽片段；然而，它无法进入淀粉样原纤维的核心，导致蛋白水解有限。然后可视化 PK 消化反应，发现了与α-syn的典型预形成原纤维(PFF) 结构相关的预期5个条带，同时仅观察到 α-syn(gS87) PFF 的3个条带（图2e）。总之，这些结果表明α-syn(gS87)确实可以形成与未修饰蛋白形成的淀粉样蛋白菌株不同的淀粉样蛋白菌株。

图2 α-syn(gS87) 原纤维的体外生成和表征

然后，作者分析了细胞和体内的α-syn(gS87)的引发聚集情况。首先通过将这些蛋白质的单体形式孵育7天(172 μM)来生成α-syn或α-syn(gS87) PFF。接下来，他们比较了两种 PFF 制剂在体外引发人类未修饰α-syn（50 μM，含 5% PFF）聚集的能力。通过监测上述沉降聚集动力学来评估引发效率，发现α-syn(gS87) PFF可以引发单体蛋白聚集，并且纤维化的程度在 24 小时内无法区分（图2f和图3）。然后对一部分 α-syn(gS87) 引发聚合反应进行 PK 消化，发现 α-syn(gS87) PFF 将其淀粉样蛋白结构模板化到未修饰的蛋白质上（图2g），并且这种模板化行为在多轮中得以维持（图2g）。并且α-syn(gS87) PFF 是可以在体外引发小鼠α-syn聚集，发现它们可以在仅12小时后达到相似的水平（图2h和图 4）。最后，作者测试了α-syn(gS87) PFF 上的 O-GlcNAc的稳定性，发现即使在 OGA 处理 72 小时后，α-syn(gS87) PFF 上的 O-GlcNAc 也相当稳定（图2j和图3）。总之这些数据显示，α-syn(gS87) PFF将其结构播种并模板化到单体、未修饰的蛋白质上，并且可以使用小鼠神经元和大脑进行相关分析。

图3 α-syn(gS87) 纤维上的 O-GlcNAc 对酶促去除稳定

图4 α-syn(gS87) PFF 在不损失多巴胺能神经元的情况下病理学减少

接着作者研究了神经元对未修饰蛋白的PFF和α-syn(gS87) PFF的处理方式是否有所不同。首先，对未修饰的α-syn和α-syn(gS87) PFF的深入表征表明，它们非常相似，都主要由低聚物上的原纤维组成，并且具有适合神经元摄取的相似长度分布（图5）。为了确定这两种类型的原纤维被神经元摄取是否存在差异，作者量化了它们在α-syn 敲除(KO)小鼠的原代神经元中的摄取情况。使用这两种PFF处理神经元后，用免疫细胞化学（ICC）检查其定位，发现两种PFF在细胞膜上积累（黄色箭头）并被神经元吸收并呈现为点状结构并均与溶酶体（LAMP1阳性囊泡）强烈共定位（图6b），表明 O-GlcNAc 修饰不会影响α-syn PFF通过内体/溶酶体途径的内化。然后使用泛(SYN1)和人类特异性(4B12) α-syn抗体对PFF处理的神经元的不溶部分进行蛋白质印迹 (WB) 分析。图6c 证实了神经元中 PFF 的内化以及α-syn(gS87) PFF的蛋白水解加工或磷酸化没有差异。最后作者研究了两种PFF在神经元内的清除情况，证实了α-syn的O-GlcNAc修饰不会改变PFF的摄取或蛋白水解加工，但可能促进其在神经元中的清除。

图5 PFF 的表征，对α-syn或α-syn(gS87)进行聚集条件(172 μM，7d)。

图6 未修饰的PFF和α-syn(gS87) PFF在神经元中表现出相似的摄取、处理和稳定性

接下来作者研究了α-syn(gS87) PFF 在神经元中的引发聚集情况。他们用α-syn或α-syn(gS87) PFF (70 nM) 处理WT小鼠幼崽的原代神经元14或21天，并使用 ICC 和 WB 分析检查种子聚集的程度（图7a）。证实 α-syn(gS87) PFF 表现出通过 pS129 测量的引发活性和病理学减弱（图7b）。同时WB定量证实，α-syn(gS87) PFFs引发内源α-syn的聚集明显减少（图7c）。然后作者通过ICC和共聚焦成像观察到，当α-syn(gS87) PFFs处理的神经元中形成聚集体时，它们大部分集中在体细胞中。与未修饰的PFF中观察到的广泛神经炎病理相比，在这些神经元的神经突中几乎没有观察到任何聚集体（图7d）。总体而言，这些数据表明，尽管 α-syn(gS87) PFF 可以在体外引发未修饰的 α-syn 的聚集，但它们在活神经元中表现出引发活性减弱。

图7 α-Syn(gS87) PFF显着降低了神经元的引发能力

图8 gS87双丝的冷冻电镜结构和原子模型以及与其他原纤维结构的比较