作为人体内第三丰富的必需过渡金属元素，铜在中枢神经系统的发育和功能调控中发挥重要作用。然而，脑部铜稳态的异常会导致氧化应激从而诱发多种神经退行性疾病。因此，开发能够用于大脑中Cu²⁺实时动态成像的分子探针对于阐明其对神经系统的调控与干预机制以及相关疾病的诊疗具有重要意义。然而，具有脑部成像能力的Cu²⁺探针的发展严重受限于血脑屏障（BBB）通透性差及时空分辨率低等问题。

针对这一现状，南京林业大学刘志鹏教授团队与南京大学郭子建院士团队展开合作，设计开发了一种可用于活体小鼠脑部Cu²⁺高时空分辨成像的小分子光声探针（图1）。结合比例型三维光声成像，该探针在帕金森病（PD）模型鼠发展和药物干预的过程中，可以精准可视化脑部不同区域Cu²⁺的动态分布。基于成像结果，作者揭示了大脑皮层、海马和丘脑区域Cu²⁺水平的变化与PD疾病之间存在密切联系。

作者前期的工作表明，具有推拉电子结构的氟硼吡咯不仅具有BBB通过潜力而且具有优异的光声成像能力（Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202214505; J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 7952-7961），通过对其进行Cu²⁺螯合团及取代基修饰，作者获得了具有BBB通过能力的光声探针PA_Cu3。PA_Cu3与Cu²⁺具有良好的比例响应行为，最大吸收波长在结合Cu²⁺后从710 nm处红移至800 nm。通过HRMS和EPR研究表明该红移吸收峰是由于Cu²⁺与PA_Cu3配位后生成了稳定的自由基阴离子[Cu²⁺-(PA_Cu3)^·-]⁺。由于细胞内Cu²⁺存在结合/非结合态两种形式，因此，作者通过解离常数（Kd）测试研究了PA_Cu3对Cu²⁺的结合能力，与体内大多数Cu²⁺螯合蛋白相比，探针表现出中等的结合能力，表明探针具有体内Cu²⁺动态检测的潜力。考虑到生物体内Cu²⁺和Cu⁺之间的共存关系，作者在选择性测试中重点探究了探针PA_Cu3对于Cu²⁺和Cu⁺的响应行为。研究结果表明PA_Cu3可以选择性地响应Cu²⁺而不是Cu⁺，证明其具有出色的氧化还原特异性响应能力。

在生物实验中，作者首先通过脑/血浆探针分配、平行人工膜体外渗透以及野生型（WT）小鼠和PD小鼠模型的脑部光声成像实验证明了PA_Cu3优异的BBB渗透能力和高分辨率成像性能。其次，结合双通道比例型3D-PA成像，在MPTP诱导PD疾病发生的过程中，对小鼠脑部进行高时空分辨成像，结果显示PA信号逐渐增强，这表明脑部Cu²⁺水平逐渐增加。作者通过对脑部PA成像后处理，提供了不同深度下更为清晰的大脑断层成像。成像结果表明在PD模型鼠发展过程中，Cu²⁺在大脑的不同区域分布有明显变化，其中，大脑皮层、海马体和丘脑的Cu²⁺含量相对较高。同时，作者通ICP-MS也验证了这些区域中Cu²⁺水平呈增加趋势。

最后，作者又研究了用不同剂量的抗氧化药物L-多巴对PD模型鼠药物干预的过程中，脑部不同区域比例光声信号的变化，进一步证明了大脑皮层中Cu²⁺水平的增加与PD疾病之间存在密切关联。结合Western blot试验，作者对PD鼠脑部Cu²⁺水平变化背后的分子机制进行了探究，实验结果表明，PD小鼠大脑中的铜稳态失衡主要受二价金属离子转运蛋白1（DMT1）的表达水平所影响。

以上研究初步证明了探针PA_Cu3在小鼠脑部具有高时空分辨成像Cu²⁺的能力，有望为脑部疾病的分子机制及诊疗研究提供支持。