为了验证糖基化是否能够帮助D型蛋白折叠，作者首先尝试使用该方法合成D-铁调素，该蛋白结构中包含四个二硫键，一度被认为难以在体外合成。作者使用固相合成法合成得到未糖基化修饰的D-铁调素，发现其难以通过传统方法正确折叠。接着作者通过固相合成将Fmoc-D-Ser (β-D-GlcNAc-(Ac)₃)-OH构建单元引入到蛋白结构中，得到了未折叠的糖基化D-铁调素多肽链1，再将多肽链1溶解在折叠缓冲液中进行折叠，HPLC表征结果表明多肽链1在一小时内完全折叠转化为糖基化D-铁调素2，回收产率为50%。质谱检测得到2的相对分子分子质量为2991.38Da（理论相对分子质量为2991.36Da），相较于1减少了7.88Da，表明2中形成了四对二硫键。随后，作者使用L-OGA处理2以移除O-GlcNAc修饰基团。HPLC结果表明L-OGA处理2小时后有接近一半的2被转化成D-铁调素3，处理12小时后2被完全转化。ESI-MS分析表明3的分子量相较于2减少了203.58Da，与被移除的O-GlcNAc相对应。之后，作者又研究了L-OGA水解D-铁调素和L-铁调素的动力学差异，得到L-OGA水解D-铁调素和L-铁调素时K_cat/K_M分别为8.88 s^-1M^-1和19.37 s^-1M^-1。表明L-OGA更偏好L-铁调素，但是这种差异并不影响L-OGA移除糖基化D-铁调素上的O-GlcNAc。作者测量了3的圆二色谱，其特征椭圆度在200nm并且具有轴对称特性，与正确折叠的L-铁调素相同，证明了得到的D-铁调素3具有正确的三维结构。因此，上述实验表明天然D构型的O-GlcNAc能够帮助D-铁调素正确折叠，并且能够被天然的L-OGA移除，同时该实验也证明了L-OGA对O-GlcNAc修饰的蛋白底物的构型不敏感。

图1.D-铁调素的合成与L-OGA水解的动力学差异

接着，作者将该方法用于合成镜像肿瘤坏死因子D-TNFα。D-TNFα是一种同源三聚体，可以用于筛选TNFα具有炎症治疗潜力的D型多肽配体，但是D-TNFα在体外的折叠效率低于10%。作者使用三段连接的方式合成带有两个O-GlcNAc修饰基团的全长D-TNFα。在选择O-GlcNAc修饰位点时，作者选择了远离二硫键以及TNFα单体相互作用表面的非结构环，该修饰位点不会干扰D-TNFα单体和同源三聚体的折叠。首先作者使用固相合成法合成了三段多肽链4，5，6，接着用自然化学连接法将三段肽链依次相连，最终得到了糖基化的全长D-TNFα（9）。整个合成过程中以肽段6为标准计算的总收率为4.3%，相较于用非糖基化可溶性标签标记的肽段6'合成得到9'，糖基化修饰使总收率提高了三倍。由于可溶性标签标记后，肽链的溶解度仍较差，因此糖基化可能是通过提高肽段的水溶性来提高合成和连接效率的。9经过氧化生成二硫键以及三聚过程后得到了糖基化的D-TNFα三聚体10，SEC回收10的收率为40%，而作为对照的9'在同样方法处理后观察到明显的沉淀，并没有三聚体生成。之后，作者使用L-OGA去除了10上的O-GlcNAc修饰，并使用尺寸排阻色谱（SEC）、质谱（LC-Q-TOF-MS）、圆二色谱（CD）以及TNFα与特异性肽段作用的表面等离子体共振（SPR）分析共同证明了具有正确二级结构的D-TNFα三聚体11的成功合成。该实验证明了O-GlcNAc修饰明显改善了TNFα折叠以及三聚过程。

图2.D-TNFα的合成示意图与MS表征

图3. O-GlcNAc修饰帮助TNFα正确折叠

最后，作者使用该方法合成了SARS-CoV-2奥密克戎刺突蛋白的镜像受体结合结构域D-RBD。作者在之前尝试使用传统方法合成拥有197个氨基酸以及四个二硫键的D-RBD，最终D-RBD的折叠效率不到0.1%。本文中，作者将全长的D-RBD分为四个肽段13,14,15,16，并引入了两个O-GlcNAc修饰基团。四个肽段分别用固相合成法合成后再用NCL连接得到全长的未折叠的糖基化D-RBD20，以肽段13为标准，计算得到的总收率为7%，而未糖基化的D-RBD20'总收率只有1.3%。20在折叠缓冲液中折叠得到折叠产物21，并使用LC-Q-TOF-MS分析证明了二硫键的形成，折叠过程总收率为50%。而未糖基化修饰的20'在折叠过程中观察到大量沉淀，并且SEC分析没有检测到折叠产物，表明未糖基化的D-BRD不能正确折叠。之后，作者使用L-OGA去除了修饰的O-GlcNAc得到正确折叠的D-BRD22，SEC、LC-Q-TOF-MS、CD以及22与特异性肽段结合的SPR分析表明合成得到的22具有正确的三维结构。

图4.D-RBD的合成示意图与MS表征

图5. O-GlcNAc修饰帮助D-RBD正确折叠