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推荐一篇发表在JACS上的文章,题目为“Tyrosinase-Based Proximity Labeling in Living Cells and In Vivo”,通讯作者是来自日本京都大学的朱浩助理教授和Itaru Hamachi教授,主要研究方向为生物细胞内有机化学修饰方法的开发。
邻近标记(Proximity labeling)是研究空间蛋白质组学的重要技术,但目前已有的邻近标记方法总存在一定的局限性,例如,APEX需要具有细胞毒性的H2O2激活,生物相容性差,BioID的标记动力学较差,TurboID受到高背景信号的影响。因此,本篇文章中作者开发了一种来自细菌的酪氨酸酶BmTyr,作为新型的邻近标记酶,实现了无H2O2、快速且低噪声的蛋白组标记。
酪氨酸酶是一种铜结合蛋白,可以与氧气结合,将苯酚或儿茶酚氧化成对应的邻醌,形成高反应性的亲电试剂,从而和邻近蛋白上的亲核位点反应,实现对邻近蛋白质组的标记。作者首先对酪氨酸酶进行了筛选,并选择了与人源酪氨酸酶相比体积更小、结构更简单且表达效果更好的来自巨大芽孢杆菌的酪氨酸酶BmTyr进行进一步研究。作者首先在体外利用荧光标记的苯酚探针证明了BmTyr可以很好地标记BSA蛋白,并通过LC-MS/MS证明了探针连接到了蛋白的赖氨酸和色氨酸残基上。作者还发现,醌可能会和细胞中丰富的亲核试剂GSH反应,但GSH反过来可以抑制醌的快速扩散,从而提高标记的空间分辨率。
接下来,作者将BmTyr标记应用于活细胞中感兴趣蛋白邻近蛋白质组的标记。作者将BmTyr与细胞核组蛋白H2B在HEK293T细胞中融合表达,作者通过外加CuCl2和苯酚探针的方式激活BmTyr,并发现缺少CuCl2、苯酚探针或BmTyr中任何一个条件都不能引发蛋白标记,其背景信号较低,优于TurboID。荧光凝胶电泳实验表明BmTyr在10 min时就可以标记出清晰的蛋白条带,其标记动力学优于需要数小时的BioID。作者还通过荧光成像测试了BmTyr在其他亚细胞器中的定位情况,并发现该酶可以实现线粒体、内质网内以及细胞表面的特异性蛋白质标记。作者还用含有脱硫生物素的苯酚探针标记蛋白,并进行了富集和质谱鉴定,作者鉴定到了645个蛋白,其中500个可以定位到细胞核。
最后,基于BmTyr标记较低的毒性,作者将BmTyr用于活体鼠脑中神经递质受体的邻近蛋白标记。作者首先在体外构建了两种神经递质受体的配体修饰的BmTyr,FITM-BmTyr和NAPS-BmTyr,分别将BmTyr锚定在代谢性谷氨酸受体Grm1和多巴胺受体Drd2上,将他们分别注射到活体鼠脑中,完成标记后将鼠脑切片进行成像或进行蛋白富集和质谱分析。FITM-BmTyr鉴定到了包含27个蛋白的蛋白质组, NAPS-BmTyr鉴定到了包含120个蛋白的蛋白质组,其中包括很多已知与Grm1或Drd2有相互作用的蛋白,证明了BmTyr用于活体标记的可靠性。
总之,作者开发了一种新型的邻近标记酶,酪氨酸酶BmTyr,可以实现活细胞与活体层面的感兴趣蛋白邻近蛋白质组的标记。
本文作者:ZCL
责任编辑:ZJ
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c13183
文章引用:DOI: 10.1021/jacs.3c13183
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