通讯作者：Christina M. Woo 哈佛大学

供稿人：黄宗煜 北京大学

    介绍一篇ACS Chemical Biology的文章，标题为“Writing and Erasing O‑GlcNAc on Casein Kinase 2 Alpha Alters the Phosphoproteome”。文章的通讯作者是来哈佛大学化学与化学生物学系的Christina M. Woo教授。

O连接的N乙酰化葡萄糖胺（O-GlcNAc）是一种在丝氨酸和苏氨酸残基中发现的单糖基化修饰。这种修饰几乎分布在细胞内的所有区域，包括细胞核、细胞质基质以及线粒体等。该修饰在蛋白质中的引入和去除分别依赖于O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GlcNAc水解酶（O-GlcNAcase，OGA）。目前，O-GlcNAc修饰和磷酸化翻译后修饰之间的关系受到了研究者的广泛关注，其中，O-GlcNAc修饰能够与磷酸化翻译后修饰共同调节细胞信号通路，此外，一些激酶中的O-GlcNAc修饰能够通过影响激酶的功能调控某些蛋白质中的磷酸化修饰。

此前的研究表明，酪蛋白激酶2α（Casein Kinase 2 Alpha，CK2α）是酪蛋白激酶2（Casein Kinase 2）中的催化亚基，能够通过位于其中的O-GlcNAc修饰执行相应的功能，但是人们目前还不清楚CK2α中的O-GlcNAc修饰对磷酸化蛋白质组的影响。本文的作者在先前的工作中将靶向识别某些蛋白质的纳米抗体与OGT（nanobody-OGT）或OGA（nanobody-splitOGA）结合，并选择性地在这些蛋白质中引入或去除O-GlcNAc修饰，进而调控其功能。在本文中，作者利用这一策略在CK2α中引入或去除O-GlcNAc修饰，并研究位于CK2α中的O-GlcNAc修饰对磷酸化蛋白质组的影响。

首先，作者同时在HEK293T细胞中过表达CK2α以及nanobody-OGT或nanobody-splitOGA（如图1所示）。随后，他们通过特异性富集EPEA标签捕获在细胞中过表达的CK2α，并利用Western blot检测位于其中的O-GlcNAc修饰。结果表明，只有当nanobody-OGT或nanobody-splitOGA能够靶向识别CK2α时，O-GlcNAc修饰才能够特异地在CK2α中引入或去除。除此之外，与广谱的OGA、OGT抑制剂Thiamet G和OMSI-4b相比， nanobody-OGT和nanobody-splitOGA对O-GlcNAc修饰在CK2α中的引入和去除影响更加显著。这些结果表明，利用nanobody-OGT与nanobody-splitOGA能够选择性地实现O-GlcNAc修饰在CK2α中的引入和去除。

图1 O-GlcNAc修饰在CK2α中的引入与去除

此前的研究表明，CK2α中的O-GlcNAc修饰主要位于347位的丝氨酸上，但是与其相邻的348位丝氨酸也有一定的可能被O-GlcNAc修饰。随后，作者通过对347位和348位丝氨酸进行定点突变检测CK2α中O-GlcNAc修饰的具体位点（如图2所示）。结果表明，当347位的丝氨酸突变为丙氨酸时，O-GlcNAc修饰不能被nanobody-OGT顺利引入，而348位的突变对结果没有任何影响，因此CK2α中的大多数O-GlcNAc修饰位于347位的丝氨酸。在此前的一些工作中，研究人员将能够被O-GlcNAc修饰的丝氨酸位点突变为半胱氨酸，从而专门研究OGT在这些位点上引入O-GlcNAc修饰的效果，因为一般来说，OGT能够在半胱氨酸上引入O-GlcNAc修饰，而位于半胱氨酸上的O-GlcNAc修饰不能被OGA识别。而在本文中，作者将347位丝氨酸突变为半胱氨酸，并尝试利用nanobody-OGT在该位点引入O-GlcNAc修饰。随后他们通过酶法标记在O-GlcNAc修饰上引入生物素（biotin）标签，利用链霉亲和素（streptavidin）富集含有O-GlcNAc修饰的CK2α，并通过与CK2α相连的FLAG标签对其进行检测。结果表明347位的半胱氨酸不能被nanobody-OGT引入O-GlcNAc修饰。因此，以上这些结果证明了本文所采用的策略在O-GlcNAc修饰研究中的可靠性。

图2 CK2α中的O-GlcNAc修饰位点位于347位丝氨酸

随后，作者在HEK293T细胞中过表达CK2α，利用nanobody-OGT或nanobody-splitOGA在CK2α中引入或去除O-GlcNAc修饰，并通过质谱检测磷酸化蛋白质组的变化，带有磷酸化修饰的蛋白质可以利用TiO2载体进行富集（如图3所示）。由于CK2α中本底的O-GlcNAc修饰丰度很低，nanobody-splitOGA对O-GlcNAc修饰的影响较小，因此作者最终在利用nanobody-OGT引入O-GlcNAc修饰的实验组中鉴定到了更多磷酸化蛋白质。一些富集程度较高磷酸化蛋白质均和CK2α中的O-GlcNAc修饰有关。

图3 CK2α中的O-GlcNAc修饰位影响磷酸化蛋白质组

除此之外，大部分和CK2α中的O-GlcNAc修饰有关的磷酸化位点都是在利用nanobody-OGT引入O-GlcNAc修饰的实验组中检测到的，并且这些磷酸化位点的富集程度均相对较高（如图4所示）。因此，以上这些结果再次验证了nanobody-OGT与nanobody-splitOGA在研究O-GlcNAc修饰如何影响磷酸化蛋白质组中的价值。

图4 CK2α中的O-GlcNAc修饰位影响磷酸化位点

总而言之，本文的作者利用与纳米抗体结合的O-GlcNAc修饰酶与去修饰酶调控特定蛋白质中的O-GlcNAc修饰，并检测目标蛋白质中的O-GlcNAc修饰对磷酸化蛋白质组的影响。他们以一个较为简单的激酶CK2α为模型验证了这一策略的可靠性，日后这一策略很可能被拓展至其他O-GlcNAc修饰的研究中，从而进行更加深入的探索。