介绍一篇发表在JACS上的文章，文章标题是“Minimalist Tetrazine N-Acetyl Muramic Acid Probes for Rapid and Efficient Labeling of Commensal and Pathogenic Peptidoglycans in Living Bacterial Culture and During Macrophage Invasion”。本文的通讯作者是特拉华大学Catherine L. Grimes。
含有炔或叠氮基团NAM探针由于尺寸小且能掺入细菌肽聚糖(PG)中，因此它通常用于研究细菌细胞壁合成的各个方面。然而，铜催化的炔-叠氮环加成(CuAAC)反应与活细胞不相容，而张力诱导的炔-叠氮环加成(SPAAC)反应速率一般，因此不适合用于追踪细菌细胞生长、重塑和分裂的时间变化。反应速率是细菌活细胞标记和成像实验的重要考虑因素。四嗪-反式环辛烯连接(Tz-TCO)是已知最快的生物正交反应，没有细胞毒性，可以在生物学相关的时间尺度和浓度下对活细菌PG进行快速标记。先前的工作通过四嗪探针提高PG表面反应动力学，但由于探针的掺入率低，此方法受到限制。NAM仅存在于细菌中，通过专门的回收酶，可以转化为PG生物合成的初始构建模块UDP-NAM，这使其成为连接生物正交手柄的理想位点。本文介绍了构建新型探针HTz-NAM的方法，该探针可以快速的进行Tz-TCO连接。
图1 NAM探针的演变。
如图2A所示，作者首先合成了HTz-NAM。为了测试荧光团掺入聚糖中的情况，作者制备了NAM的荧光偶联物。在先前的报道中NBD-NAG能够用于追踪活细胞中O-GlcNAc修饰的蛋白质，4-DMAPth已被广泛用作研究蛋白质-蛋白质相互作用的显色荧光团，作者调整了方案，将它们与NAM相连接。作者通过大肠杆菌工程菌株EQKU模型，检测了新合成的探针与代谢掺入系统的相容性，该菌株能够将多种NAM探针掺入其细胞壁中。该菌株敲除MurQ，限制NAM-6P分解代谢为NAG。EQKU还包含P. putida的回收酶AmgK和MurU，这些酶被编码到IPTG诱导的质粒中，使NAM底物能够融入成熟的PG(图2B)。作者通过化学酶法观察到糖探针被AmgK转化为相应的α-1-磷酸产物，然后被MurU转化为UDP-糖(图2B)。AmgK可以耐受多种修饰，并且能够将所有三种NAM探针转化为相应的磷酸糖(图2B)。
图2 HTz-Pfp-ester、NBD-NAM、4-DMAPth-NAM、HTz-NAM的合成
在确认UDP-HTz-NAM前体可以通过化学酶法产生后，作者将其整合到EQKU整个细菌PG中进行验证(图2C)。在致死剂量的磷霉素作用下，使用不同浓度的HTz-NAM探针(0.06 mM至6 mM)进行生长恢复试验，以确定重塑细菌活力过程中所需HTz-NAM的最低浓度。磷霉素通过MurA抑制了PG从头合成的第一步，这阻止了细胞从UDP-NAG自然产生UDP-NAM。HTz-NAM能够在0.15 mM的探针浓度下挽救细菌细胞生长，从而表明该探针可以通过产生UDP-HTz-NAM来维持磷霉素存在下的细菌生长，然后将其转运到PG生物合成中(图2D)。为了进一步验证探针是否直接整合到细菌PG中，作者用溶菌酶处理重塑后的细胞，将PG消化成不同的NAG/NAM双糖亚基。通过高分辨率质谱(HRMS)对消化后的样品进行分析，观察到其含有Tz片段 (图2E)，这证明HTz-NAM确实被掺入PG中。在确认HTz-NAM被整合到PG中后，作者进一步在细胞壁中使用可视化探针。作为HTz-NAM的生物正交偶联对，作者使用了aTCO类似物，它具有快速动力学和物理化学特性的良好的有利组合，可以实现细胞渗透性和快速洗脱。在磷霉素和IPTG存在的情况下，作者用HTz-NAM处理EQKU菌株60分钟(图3A)，固定后再用aTCO-TAMRA处理后，用共聚焦显微镜观察细胞。结果显示，与用NAM和荧光团处理的细胞相比，HTz-NAM组可以观察到细胞外周和FtsZ-隔膜分裂环的标记(图3B)，这种标记优于先前报道的MeTzPh-NAM探针。
图3 HTz-NAM的PG结构可视化及Tz-TCO连接动力学
接下来作者将此探针标签扩展到共生菌和致病菌，以评估该探针的通用性。模型EQKU菌株是革兰氏阴性菌株，其PG层较薄，被涂有脂多糖(LPS)的较厚外膜包围。作者推测HTz-NAM将适用于缺乏外膜的革兰氏阳性物种的标记策略。利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-KU, BSKU)，在其基因组中携带Amgk和MurU，使用NAM探针可以观察到有效的标记(图4A)。此外，两株大肠杆菌DH5α-Tf-KU和RFM795-Tf-KU与其他大肠杆菌菌株(图4A,B)一样，可以用NAM探针进行重塑，使用各种荧光团，可以在固定和活标记中显示所有细菌类型的细胞壁(图4A)。这些在各种细菌中标记PG的初步发现表明，HTz-NAM是一种有效的工具，可以标记革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌PG。除了转基因菌株外，作者希望将HTz-NAM标记扩展到天然回收PG的菌株中。两种特性良好的假单胞菌P.putida和P.aeruginosa，天然含有PG回收酶AmgK和MurU。铜绿假单胞菌是一种机会致病菌，这些细菌和其他细菌一样，能够脱落和改造它们的PG结构；然而，很少有研究能够区分PG作为感染期间的明确毒力因子。在这里，作者试图利用快速和强大的HTz-NAM探针在活细菌中实行PG解剖结构的动态原位标记。使用HTz-NAM和aTCO-SiR标记策略显著改善了P.putida中经过NAM处理样品的标记效果，并且显著降低了背景(图4A）。有趣的是，在AmgK/MurU机制的基础表达下，将该探针应用到P.aeruginosa上，在未经洗涤的样品中，标记率显著提高(图4A)。这些结果表明，这种新的最小四氮探针可以很容易地用于检测活体患者样本中的铜绿假单胞菌。这种动态探针也可以作为研究PG原位空间和时间变化的平台。为了突出新成像方法的功能和多功能性，作者对每个细菌菌株的生长阶段进行了详细的成像分析（图4B）。假单胞菌菌株的共聚焦成像首次提供展示了这种生物在肽聚糖中发现的聚糖结构，它显示了细菌细胞生长周期不同阶段的碳水化合物骨架(图4C)。在未来，有希望使用这种标记策略作为一种有效的方法来筛选新的抗生素。
图4 HTz-NAM重塑在各种细菌物种中的多功能性。
接下来，作者希望它能转化为专门利用巨噬细胞的免疫相关系统，巨噬细胞是一种先天免疫细胞类型，它吞噬并分解细菌，引发触发免疫系统的下游信号通路。简而言之，作者使用先前建立的细菌入侵方案，将HTz-NAM重塑的大肠杆菌引入巨噬细胞中培养。用抗生素庆大霉素处理细胞，以消除任何胞外细菌。将细胞固定并用aTCO-TAMRA或aTCO-SiR标记。巨噬细胞中能够观察到标记的细菌，非特异性标记受到限制(图5A)。作者还用Tz探针预点击重塑的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，以实时监测细菌的入侵和巨噬细胞的吞噬(图5B)。
图5 巨噬细胞吞噬细菌的成像
除了可视化预标记细菌的吞噬外，aTCO-SiR偶联物的强大功能之一，是其具有快速反应动力学的荧光标记能力。为了证明这些，作者测试了标记已经被巨噬细胞吞噬的细胞内细菌的能力(图6)。入侵后，作者将aTCO-SiR (500 nM)添加到活细胞培养基中，并立即观察内化细菌的摄取和标记。在5分钟内，巨噬细胞内已经内化的细菌被特异性地标记在细胞壁上(图6B)。这种免洗标记能够特异性的发生在活的巨噬细胞内的活的胞内细菌细胞壁上，这与之前的SPAAC标记不同。这项工作可以扩展到选择性地标记和跟踪特定的细胞内病原体，例如沙门氏菌和军团菌，这些病原体为了避免降解可以在细胞质中复制，通过这种方式可以实时可视化这些复杂的机制。
图6 巨噬细胞吞噬Htz -NAM重塑细菌的Tz-TCO的实时可视化。
总之，作者开发了一种新的NAM衍生物HTz-NAM探针，它与aTCO标记相结合，可以实时快速和选择性地标记细菌PG。相比之下，HTz-NAM/aTCO系统的标记可以在在低浓度下，几秒钟内完成。这是第一个在宿主巨噬细胞内细菌PG的活体免洗选择性标记兼容的系统。HTz-NAM标记系统将在生物系统先天免疫研究中有许多应用。这些最小的探针为临床新成像模式的发展和高通量筛选开发抗生素奠定了基础。
本文作者：CHY
DOI：10.1021/jacs.3c13644
责任编辑：LD
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