杨铭栋，北京大学

   介绍一篇 ACS Chem. Biol. 的文章“Asparaginyl Ligase-Catalyzed One-Step Cell Surface Modification of Red Blood Cells”，文章来自哈佛医学院的 Hidde L. Ploegh 课题组，其课题组专注于通过应用化学策略来解决细胞生物学和免疫学问题。本文中，作者通过天冬酰胺连接酶在温和条件下实现了对红细胞膜表面的修饰。 

红细胞作为药物、多肽、蛋白质和纳米颗粒的载体备受关注。一方面，红细胞可以在人体血液循环中存活 120 天，具有非常好的稳定性；此外，红细胞具有较好的生物相容性，且可以令负载在其表面的结构产生免疫耐受；同时红细胞不分裂，本身的内吞等细胞活动较少，可以保证其表面的修饰分子长时间存在。然而，目前常用的改造策略都存在一定的缺陷。例如，基于 NHS 靶向红细胞表面氨基的反应策略需要将生物素化基团、链霉亲和素和生物素化蛋白（POI）依次连接到红细胞表面，以实现红细胞的标记。这种策略需要多步反应，既缺乏反应的特异性，又可能损伤红细胞的结构和生物稳定性。因此，部分研究者试图通过基因工程的策略实现红细胞表面生物分子的呈递。但是，这一策略需要花费大量的时间，且仅限于呈递肽段和蛋白，因此应用受到了极大限制。本文中，作者基于先前开发的天冬酰胺连接酶系统 OaAEP1，实现红细胞表面的“一步法”标记（如图 1 所示）。

图 1. 细胞表面修饰策略比较。A）基于生物素化的策略；B）基于基因修饰的策略；C）本文工作：基于 OaAEP1 介导的细胞表面修饰。

本文作者使用的连接酶是 OaAEP1 的突变体，Cys247Ala-OaAEP（此后简称 AEP），其可以识别一个三肽基序 Asn-Xaa-Yaa，并实现标记。其中 Xaa 残基通常是一个疏水的脂肪族氨基酸。识别序列中天冬酰胺形成的硫酯中间体可以被蛋白质或肽段的氮端亲核基团进攻以得到连接产物。虽然这种酶对 Asn-Gly-Leu 序列具有明显的特异性，但它能耐受许多不同的肽序列。 

首先，作者开发并验证了该策略的可行性。作者使用一个氮端生物素修饰的 RNGL-COOH 肽对 AEP催化小鼠红细胞表面标记的条件（温度、时间和酶浓度）进行了优化（图 2A）。通过流式细胞术及免疫印迹的结果，作者发现将温度从 4℃ 升高至 37℃，同时延长培养时间，可以提高红细胞表面修饰的效率；其外，当 AEP 浓度为 2 μM 时，红细胞标记效率达到平台期（图 2B、C）。经比较，作者发现 37℃ 下，50 nM 的 AEP 在 2h 可以实现 2×10⁶ 个小鼠红细胞的最优生物素化标记。同时，与之前研究者开发的 Sortase A 连接系统相比，AEP 具有更高的标记效率（图 2C）。此外，通过对细胞形态与自然清除过程的分析，作者发现，AEP 的标记不会影响红细胞的形态（图 2C），且标记后与天然红细胞的循环半衰期基本一致（图 2E、F）。这些结果表明，AEP 可以在温和条件下对红细胞进行“一步法”修饰，为之后红细胞修饰功能性生物分子奠定了基础。

图 2. AEP 介导的红细胞表面标记条件的优化。A）AEP 介导的野生型红细胞生物素标记的方案；B）流式细胞术检测不同 AEP 浓度和孵育时间下的红细胞标记效率；C）反应时间及反应浓度对 AEP 标记效率的影响，及其与 Sortase A 标记的比较；D、E、F）修饰对红细胞形态、存活及自然循环半衰期的影响。

在确认 AEP 对红细胞表面标记的潜力后，作者利用红细胞引发免疫耐受的性质，尝试是否可以通过在红细胞表面修饰免疫原性肽段以增强机体的免疫耐受能力。在小鼠Ⅰ型糖尿病加速模型（T1D）中，免疫细胞会对胰岛 β 细胞进行杀伤，从而导致小鼠的胰岛素水平降低，进而导致血糖水平的上调和糖尿病的发生。他们利用 AEP 将免疫细胞靶向的底物肽段序列 p31 标记到红细胞表面（图 3A），并将标记后的红细胞注入到小鼠体内（诱发糖尿病模型后一天，图 3B），希望以此降低胰岛 β 细胞的损伤。结果显示，修饰后的红细胞可以在很长一段时间内有效地降低小鼠体内的血糖水平（图 3C、D），并且降低相关淋巴器官及胰腺中免疫细胞的数量（图 3E）。此外，通过成像，作者发现导入修饰红细胞小鼠的 β 胰岛可以保持完整（图 3F）。

图 3. AEP 介导的红细胞 p31（T1D 相关模拟表位）修饰对 T1D 的预防作用。A）用 p31 肽标记红细胞的方案；B）实验流程；C、D）用未修饰的红细胞（黑色）或 p31 修饰的红细胞（红色）处理小鼠 60 天后血糖水平；E）流式细胞仪检测免疫细胞在培养终点的浸润情况；F）接种 RBC 或 RBC-p31 小鼠胰腺组织的染色情况。

此后，作者将 AEP 与多种连接方式联用，进一步拓展了标记策略。首先，他们设计并合成了三功能连接子，即以半胱氨酸为核心，氨基端连接三个甘氨酸，且羧基端连接 RNGL（图 4A）。基于此，他们可以通过马来酰亚胺实现半胱氨酸巯基的特异性荧光标记，使用 Sortase A 与 GGG 序列实现偶联标记，最后利用 AEP 在 RNGL 上连上合适基团，以此实现正交三重标记。作者选择 VHH05（识别并结合来源于 Ubc6e 的短肽）及 VHH A12（与  PD-L1结合）两种纳米抗体进行尝试（图 4B）。结果显示，两种纳米抗体都可以通过该策略修饰到红细胞表面；且通过流式细胞术分析，作者发现修饰到红细胞表面的纳米抗体仍保持与相应抗原的结合能力。随后，作者也成功实现了两种纳米抗体的同时标记（图 4C）。

图 4. 利用三功能连接子对红细胞进行纳米抗体标记。A）三功能连接子的化学结构；B）通过 Sortase A 实现 VHH05 和 VHH A12 的荧光三功能连接子的标记；C）红细胞标记效率的验证。

最后，作者还在体外验证了修饰纳米抗体的红细胞对癌细胞的靶向能力。结果显示，AEP 介导的纳米抗体修饰赋予了红细胞特异性靶向肿瘤细胞的能力（图 5）。

图 5. 纳米抗体修饰的红细胞与肿瘤细胞结合能力的研究。A）实验方案；B）不同细胞混合物的流式细胞术检测。

综上，作者设计并开发了天冬酰胺连接酶 AEP 的生物正交连接体系，实现了在红细胞表面温和且快速的“一步法”标记。这一策略拓展了红细胞标记相关治疗策略的应用范围，对后续发展具有重要意义。