吡咯赖氨酸（Pyl）是迄今为止发现的第 22 种蛋白质氨基酸。它主要存在于古菌甲胺甲基转移酶中，是甲胺分解代谢的关键酶。尽管有基因编码，但它的生物合成需要翻译后修饰，即甲基化的吡咯啉羧酸片段与一个 l-赖氨酸分子的 Nε-原子结合（图1a）。基因研究表明，它的生物合成需要三种酶： (i) PylB，将一分子 l-赖氨酸转化为 (3R)-3-甲基-d-鸟氨酸（3Me-Orn）；(ii) PylC，催化 3Me-Orn 与第二个 l-赖氨酸的连接； 和 (iii) PylD，在自发水消除之前将生成的 (3R)-3-methyl-d-ornithyl-Nε-l-lysine 氧化为 (3R)-3-methyl-d-glutamyl-semialdehyde-Nε-l-lysine（图1b）。PylB 属于自由基 S-腺苷-l-甲硫氨酸（SAM）酶超家族。这些蛋白质利用由三个保守半胱氨酸残基协调的[Fe4S4]簇的还原作用，将 SAM 还原裂解为 l-蛋氨酸和 5′-脱氧腺苷自由基物种（5′-dA^•;图1c）。后者在大多数情况下又会从酶的底物中抽取一个氢原子，引发基于自由基的反应，导致产物的形成。20 多年前发现的自由基 SAM 酶现在被认为是规模最大、种类最多的酶超家族。然而，我们对其结构和机制的了解仍然有限。来自 Methanosarcina barkeri Fusaro 的 PylB（MbPylB）早在十年前就被确定了结构特征，并被证明只含有一个专门用于 SAM 结合和裂解的 [Fe₄S₄] 簇。有趣的是，晶体结构显示该酶在活性位点与 SAM 及其产物 3Me-Orn 共同结合。人工将 l-lysine 与活性位点空腔对接后，提出了一种破碎-重组机制，首先由 5′-dA^• 提取 Cγ H 原子，导致 Cα-Cβ 键断裂，然后通过 Cα-Cγ 键的形成进行重组（图1d）。在这一反应过程中，Cα 原子的绝对构型从 S 反转为 R。迄今为止，由于之前的尝试未能证明 PylB 使用 l-赖氨酸作为底物，因此没有进行后续的生化鉴定来证实这一机理。PylB 属于催化氨基酸 C-C 键断裂的自由基SAM酶亚群，包括 ThiH、HydG、NosL和 F₀-合成酶，它们分别参与了主要的生物合成途径（即硫胺素、[FeFe]-氢化酶的有机金属 H 簇、正庚内酯和辅助因子 F₄₂₀ 的生物合成）。有趣的是，ThiH、HydG 和 NosL 都具有相同的 (βα)₈ TIM 桶状折叠，其 RMSD 在 2 至 3 Å 之间。它们都从各自底物的氨基氮中抽取一个 H 原子。然而，尽管 PylB 与这些酶的结构高度相似，但有人认为 PylB 会以不同的方式激活其底物，以断裂 l-赖氨酸 Cα-Cβ 键，从而完成随后的重组步骤（图 1d）。

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       在这里，法国Univ. Grenoble Alpes的Yvain Nicolet等人将生化、分析、合成和光谱方法与理论计算相结合，探讨了 PylB（MbPylB）的机理。作者证实该酶在体外以 l-lysine 为底物生成 3Me-Orn 。除此之外，作者团队还发现该酶还能将 3Me-Orn 转化回 l-赖氨酸。通过稳定同位素标记实验，作者证明了 PylB 从其底物的 Cγ 中抽取了一个 H 原子，并在 3Me-Orn 生成的时间过程中成功捕获了由此产生的以 Cγ 为中心的 L-赖氨酰自由基中间体。引人注目的是，该标记实验支持 PylB 循环利用 5′-dA^• 自由基进行多次翻转。最后，作者证明了 PylB 会产生 5′-硫代腺苷（5′-tA^• ），这是一种不寻常的酶副产物，其来源和形成可能是 5′-dA^• 与[Fe₄S₄]簇的偶然反应。综上所述，作者团队的研究结果支持将L-赖氨酸转化为 (3R)-3- 甲基-d-鸟氨酸的破碎-重组机制，并揭示了自由基 SAM 酶的不寻常反应性。

标题：Radical S-Adenosyl-l-Methionine Enzyme PylB: A C-Centered Radical to Convert l-Lysine into (3R)-3-Methyl-d-Ornithine

作者：Feryel Soualmia, Mickael V. Cherrier, Timothée Chauviré, Mickaël Mauger, Philip Tatham, Alain Guillot, Xavier Guinchard, Lydie Martin, Patricia Amara, Jean-Marie Mouesca, Meriem Daghmoum, Alhosna Benjdia, Serge Gambarelli*, Olivier Berteau*, and Yvain Nicolet*

链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c03747