RNA在中心法则中扮演着承上启下的重要作用，RNA的选择性标记和可视化对于研究其分子机制和生物功能意义重大。目前已经开发了多种用于RNA成像的策略，主要包括基于荧光原位杂交（FISH）等技术的固定细胞RNA成像策略和基于荧光蛋白、荧光标记RNA等手段的活细胞成像策略。基于寡核苷酸和蛋白质的成像方法往往需要借助转染和递送等额外策略进入细胞，而小分子荧光染料具有细胞渗透性好等优点，在活细胞成像中具有独特优势。然而目前可用于活细胞RNA成像的小分子染料仍然十分缺乏，商业化染料仅有SYTO RNASelect一种，且其成像特性仍有很多不足之处。在本文中，作者们对先前报道的特异性结合RNA的苯乙烯染料进行改造，尝试开发可用于活细胞中RNA成像的高性能荧光探针。

含有吲哚结构的苯乙烯染料之前被报道能够在活细胞中对RNA进行选择性标记和成像，但其量子产率和成像信噪比有待进一步提高。为了改善染料的光学性质和量子产率，作者尝试对该类苯乙烯分子进行化学修饰和改造，通过调整吲哚环上的取代基和将吲哚替换为吲哚嗪等策略合成了一系列新的苯乙烯染料。之后作者对这些染料的吸收、发射、摩尔吸收率和荧光量子产率等光物理性质进行了评估，发现吲哚嗪取代的两种染料（1c和1d）展现出良好的成像潜力。相比于母体苯乙烯染料（MPI），它们具有更高的量子产率和明显的红移（>50 nm），并且在结合RNA分子之后表现出更明显的荧光信号增强。

为了评估染料的实际成像效果，作者随后在活细胞和固定细胞样品中使用1c和1d对RNA进行了成像。从活细胞成像可以看出，1c或1d的荧光信号主要出现在核仁和细胞质中，与染料对RNA的选择性一致，并且其信号强度和对比度明显高于MPI染料。除此之外，这两种染料在可视化核仁时具有出色的动力学和灵敏度，孵育2分钟便可观察到明显的核仁信号。后续固定细胞中的成像证明了这两种染料也可用于固定样品中的RNA可视化，并且与Hoechst染料兼容。此外，作者们发现该染料还与荧光寿命成像显微镜（FLIM）兼容，可以观察到1c在不同的亚细胞位置时展现出不同的荧光寿命：核仁（3.4 ns），细胞核（2.5 ns），细胞质（1.6 ns）和未结合染料时（0.82 ns）。

为了更全面评估染料的活细胞成像可用性，作者对染料的细胞毒性和光稳定性进行了表征。得益于该染料良好的荧光性能和高信噪比，该染料在正常工作浓度下几乎不具有细胞毒性。之后作者在HeLa细胞中进行了光漂白实验，发现在连续的激光照射下，1c和1d表现出更高的光稳定性，其半衰期是商业化染料SYTO的一倍以上。

得益于该染料的优良性能，作者还将其应用于核仁的亚结构成像分析和RNA凝聚物的分析。作者使用染料1c对核仁进行染色分析，发现核仁中的GC（颗粒成分）区域具有更强的荧光信号，而FC（纤维中心）和DFC（致密纤维组分）则呈现为较暗的区域，这与GC区域含有丰富的rRNA相吻合。在体外液-液相分离（LLPS）实验中，作者证明染料1c可以有效的可视化RNA凝结物中的RNA，展现出良好的应用潜力。

总而言之，作者们通过对苯乙烯类RNA探针进行化学改造，得到了能够在活细胞中对RNA进行高效成像的小分子染料，具有更强的荧光信号响应，低细胞毒性和良好的光稳定性，有望成为市售RNA染料SYTO的良好替代品。