分享一篇最近发表在Nature Chemical Biology上的文章“Ubiquitin-specific proximity labeling for the identification of E3 ligase substrates”。文章的通讯作者是来自美国Broad Institute of Harvard and MIT癌症项目的主任William R. Sellers，他们致力于研究癌症相关基因以及开发新的癌症筛查和治疗方法。
蛋白的泛素化过程是真核细胞中调节蛋白降解的关键过程，这一紊乱和多种疾病发生相关。近年来研究者们设计了多种影响靶蛋白泛素化过程的小分子降解剂，它们被认为是新型的治疗药物。虽然人体内有600多种E3泛素连接酶，但是他们的底物仍未被完全发现，这也限制了对泛素化过程功能的理解以及相关治疗药物的开发过程。在本文中，作者基于邻近标记技术开发了新型的E3泛素连接酶底物鉴定方法E-STUB（E3-substrate tagging by ubiquitin biotinylation）。在这一方法中，他们将感兴趣的E3连接酶和BirA融合表达、将泛素蛋白和生物素受体肽BAP融合表达，共同转染到细胞中。E3连接酶识别并泛素化底物后，在外加生物素的条件下，BirA就会将生物素共价转移到底物泛素链的BAP上，从而给泛素化底物加入生物素标签，用于后续的富集和底物鉴定。作者首先在证明了E-STUB能够成功生物素化E3连接酶CRBN的一些已知底物，并优化了BAP的序列来防止过高的生物素化背景信号。之后，作者分别使用蛋白酶体抑制剂、PROTAC降解剂或分子胶处理细胞来影响泛素化过程，并通过质谱检测生物素富集到的蛋白，发现E-STUB能够成功反应到已知目标底物的泛素化变化，证明了这一方法的有效性。之后，作者将其拓展到鉴定四种的多激酶PROTAC小分子的靶点上，这些降解剂会诱导CRBN泛素化降解一百多种激酶靶点。作者系统对比了降解剂处理后的蛋白生物素化水平和丰度变化，发现已知靶标的生物素化水平增加且蛋白丰度减少，但是这些PROTAC小分子都会导致一部分蛋白被泛素化但不会被降解；此外，还有一些和靶标相关的蛋白也出现了降解。作者进一步使用了两种分别招募E3连接酶CRBN或VHL的HDAC降解剂测试对靶标和已知靶标相关共抑制复合物成员的影响。他们发现对PROTAC降解不敏感的HDAC1/2也发生了生物素化，但是可能由于缺乏聚泛素链所以降解并不明显；此外，靶标相关共抑制复合物成员也发生了明显的生物素化和降解，说明针对HDAC复合物的也会影响这些复合物成员的生物素化降解。最后，作者还希望用E-STUB发现生理条件下的E3连接酶底物。通过比较VHL与CRBN的底物差异以及VHL底物结合或装配缺陷突变体的底物差别，作者们发现HIF1A是VHL的底物之一。总之，本文作者开发了一种依赖临近标记E-STUB工具，可以用于研究E3连接酶的功能并发现新底物。文章链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01590-9原文引用：DOI: 10.1038/s41589-024-01590-9
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